Summary

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

Published: February 24, 2023
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Summary

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ の自発運動を評価し、高解像度ビデオ録画に基づいて各フレームのピクセルをセグメント化し、速度、距離などのパラメータを計算するプラグインと互換性があります。

Abstract

ショウジョウバエは 、高度な遺伝子操作技術が豊富で、多様な行動特徴があるため、さまざまな疾患を研究するための理想的なモデル生物です。動物モデルにおける行動不全の特定は、例えば、患者が運動機能の障害を経験することが多い神経変性疾患において、疾患の重症度の重要な尺度である。しかし、薬物治療やトランスジェニック個体など、ハエモデルの運動障害を追跡および評価するためのさまざまなシステムが利用できるため、複数の角度から正確に評価するための経済的でユーザーフレンドリーなシステムはまだ不足しています。ここでは、フィジーの画像処理プログラムと互換性のある AnimalTracker アプリケーションプログラミングインターフェース(API)に基づく手法を開発し、記録されたビデオから成虫と幼虫の両方の個体の移動活動を体系的に評価し、追跡行動の分析を可能にします。この方法は、行動を記録および分析するために高解像度カメラとコンピューター周辺機器の統合のみを必要とするため、トランスジェニックまたは環境行動障害のあるハエモデルをスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。薬理学的に処理されたハエを用いた行動試験の例を挙げて、成虫のハエと幼虫の両方の行動変化を再現性の高い方法で検出する方法を示します。

Introduction

ショウジョウバエメラノガスターは、遺伝子改変1、薬物治療2、老化3によって作成された神経疾患モデルにおける細胞および分子機能を調べるための優れたモデル生物を提供します。ヒトとショウジョウバエの間の生物学的経路、物理的特性、および疾患関連ホモログ遺伝子の高い保存により、ショウジョウバエは分子レベルから行動レベル4までの理想的な模倣になります。多くの疾患モデルにおいて、行動不全は重要な指標であり、さまざまなヒトニューロパシーに有用なモデルを提供します5,6ショウジョウバエは現在、複数のヒト疾患、神経発達、およびパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の研究に使用されています7,8。疾患モデルの運動能力を検出することは、病原性の進行を理解するために重要であり、疾患プロセスの根底にある分子メカニズムとの表現型の相関関係を提供する可能性があります。

最近、市販のソフトウェアツールと費用対効果の高いプログラムが、グループ化されたハエ9,10でのハイスループットテストやリアルタイムでの移動の測定11,12など、ショウジョウバエの自発運動検出戦略のために開発されました。そのような従来のアプローチの1つは、クライミングアッセイとも呼ばれる迅速なインタラクティブネガティブジオタキシス(RING)であり、同じ性別と年齢の大規模なハエの個体群を封じ込めることを可能にする複数のチャネルを含み、データ収集中の変動を減らします9,13。自発運動挙動を分析するための別の事前試験方法は、TriKinetics ショウジョウバエ活動モニタ(DAM)であり、これは、薄いガラス管14内のハエ活動運動を検出するために複数のビームを使用する装置である。この装置は、位置を連続的に記録し、これは、より長い期間にわたるハエの活動および概日リズムを研究するためにビーム交差を計算することによって自動移動を表す15。これらの方法は、ショウジョウバエの行動欠陥を分析して行動移動の変化を決定する際に広く使用されてきましたが、常に特別な試験装置または複雑な分析プロセスが必要であり、限られた単純な装置で一部のモデルでは適用が制限されています。FlyGrAM11やショウジョウバエアイランドアッセイ10など、成虫のショウジョウバエをテストするための動物追跡グループベースの戦略は、事前定義された領域で社会的募集と個々の追跡を実装します。それにもかかわらず、反抗された地域での社会的個人的制限は、ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の識別に悪影響を与える可能性があります。TRex16、MARGO 12、FlyPi17などのオープンソースのマテリアルベースの方法には緊急事態がありますが、行動テストで柔軟に使用することで、ハエを迅速に追跡できます。これらのテストアプローチは、精巧な実験装置の設置、特別なソフトウェア要件、またはプロのコンピューター言語に関連しています。幼虫の場合、単位時間18あたりのグリッド境界線の数を横切って移動した総距離を測定するか、または個人の体壁収縮を手動で大まかに数えること19は、自発運動能力を評価するための主要な方法です。機器や装置、分析方法の精度が不足しているため、幼虫の行動移動が検出を逃れ、行動運動、特に微細な動きを正確に評価することが困難になる可能性があります15

本開発手法は,画像処理プログラム「フィジー(ImageJ)」と互換性のあるアプリケーションプログラミングインターフェース(API) AnimalTracker を利用し,高精細(HD)映像からハエの追跡行動を解析し,成虫と仔魚の運動活動を系統的に評価する手法である.フィジーはオープンソースソフトウェアです ImageJディストリビューション 堅牢なソフトウェアライブラリと多数のスクリプト言語を組み合わせることができるため、画像処理アルゴリズムのラピッドプロトタイピングが可能になり、画像分析機能で生物学者の間で人気があります20。現在のアプローチでは、フィジーの AnimalTracker APIへの統合を利用して、パーソナライズされたアルゴリズム挿入を備えた独自の ショウジョウバエ 行動アッセイを開発し、自発運動行動の堅牢な分析機能をサポートするための詳細なドキュメントとチュートリアルの有用なステップを提供します(図1)。ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の客観的識別の複雑さを回避するために、各アリーナは1つのハエのみをホストするように制限されています。アプローチの追跡精度を評価した上で、パーキンソン病の動物モデルに一般的に使用されている毒性薬物ロテノンを投与された ショウジョウバエ の運動運動を追跡および定量化するために実施され、最終的に薬物治療における移動障害を発見した21。オープンソースでフリーなソフトウェアを採用したこの方法論は、高コストの計測を必要とせず、 ショウジョウバエ の行動運動を正確かつ再現性よく解析することができます。

Protocol

W1118 成虫のハエと3齢幼虫を本研究に用いた。 1. 実験準備 注: ショウジョウバエ の移動追跡のためのオープンフィールドアリーナは、無色無臭のシリカゲルで作られています。 試薬Aと試薬Bを、シリカキットの製造元の説明書に従って1:10の比率で混合します( 材料表を参照)。色が白に変わるまで…

Representative Results

本研究では、ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫の自発運動障害を調べ、薬物溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)を与えられた対照ハエの運動活動と比較しました。ショウジョウバエにおけるロテノンによる治療は、脳22においてドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こし、重大な自発運動障害23を引き起こすことが示されている。図<strong cla…

Discussion

フィジーの画像処理プログラムと互換性のあるオープンソースの AnimalTracker APIに基づいて、研究者が成虫と個々の幼虫の両方のハエを追跡することにより、自発運動活動を体系的に評価できるようにする方法を設計しました。 AnimalTracke はJavaで書かれたツールであり、既存のデータベースや他のツールに簡単に統合して、アプリケーションで設計された動物の追跡行動の分析を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、東呉大学と中国国家科学財団(NSFC)(82171414)からの特別打ち上げ基金によって支援されました。Chunfeng Liu教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

References

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

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Cite This Article
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

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