Summary

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.

Abstract

La morfología compacta de las neuronas ganglionares del oído interno aisladas y cultivadas permite caracterizaciones detalladas de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores que contribuyen a la diversidad celular en esta población. Este protocolo describe los pasos necesarios para la disección, disociación y cultivo a corto plazo exitosos de la somata de las neuronas bipolares del oído interno con el fin de realizar registros de pinzas de parche. Se proporcionan instrucciones detalladas para preparar las neuronas ganglionares vestibulares con las modificaciones necesarias para colocar placas en las neuronas ganglionares espirales. El protocolo incluye instrucciones para realizar registros de patch-clamp de celda completa en la configuración de patch perforado. Los resultados de ejemplo que caracterizan los registros de pinza de voltaje de corrientes mediadas por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización (HCN) resaltan la estabilidad de la configuración de registro de parches perforados en comparación con la configuración de parches rotos más estándar. La combinación de estos métodos, somata aislado más registros de pinza de parche perforado, se puede utilizar para estudiar procesos celulares que requieren registros largos y estables y la preservación del medio intracelular, como la señalización a través de receptores acoplados a proteínas G.

Introduction

Las neuronas bipolares del nervio vestibulococlear conectan las células ciliadas sensoriales del oído interno con el tronco encefálico. Son los principales portadores de información sobre el sonido y los movimientos de la cabeza; El daño a estas células importantes conduce a la sordera y a los trastornos del equilibrio. Las porciones vestibular y auditiva del nervio están compuestas por distintos tipos de células que son morfológica y funcionalmente diversas 1,2. En el sistema vestibular, dos subpoblaciones aferentes disparan espontáneamente a intervalos regulares o irregulares2. Se cree que la sincronización de picos aferentes refleja una diversidad subyacente en la composición de los canales iónicos 3,4. En el sistema auditivo, hay dos subpoblaciones principales de neuronas ganglionares espirales (SGN); mientras que las SGN de tipo I entran en contacto con células ciliadas internas individuales5, las SGN de tipo II contactan con múltiples células ciliadas externas5. Los registros in vitro de cultivos semiintactos y organotípicos sugieren diferencias en las propiedades de membrana de las SGN de tipo I y tipo II 6,7.

Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de estas neuronas también se encuentran en sus cuerpos celulares. Como tal, los cultivos del soma vestibular aislado y del ganglio espiral se pueden estudiar in vitro para comprender cómo los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores contribuyen a la respuesta de estas neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares aislados permite registros eléctricos de alta calidad, adecuados para la caracterización detallada de canales iónicos dependientes de voltaje y receptores de neurotransmisores. El fácil acceso a una variedad representativa de subtipos de neuronas permite un análisis de alto rendimiento de la diversidad celular.

Este artículo presenta un método para aislar y cultivar cuerpos de células ganglionares disociadas de la porción superior del ganglio vestibular en ratas en el día postnatal (P)9 a P20. También se proporcionan sugerencias para extender estos métodos al ganglio espiral, además de los pasos necesarios para extraer, disociar y colocar placas con éxito en las células ganglionares. Estos métodos son una evolución de los ideados en publicaciones de diversos laboratorios 8,9,10. También se incluye en este documento una guía para seleccionar células sanas para los registros de patch-clamp.

Por último, el protocolo describe el procedimiento para el registro de patch-clamp utilizando la configuración de patch-patch-perforado11. Aunque la configuración de parche perforado requiere más tiempo y es más desafiante técnicamente que la configuración de parche roto más común, es mejor para mantener el entorno citoplasmático que permite sesiones de grabación largas y estables. Los beneficios de esta configuración de grabación se ilustran aquí a través de la estabilidad mejorada de las corrientes catiónicas activadas por hiperpolarización en parches perforados en relación con los registros de parches rotos.

Este protocolo está organizado en cinco secciones. En las secciones 1 a 3 se describen las soluciones y herramientas que se pueden preparar y almacenar con antelación. En la sección 4 se describen los pasos para la disección y la siembra de las células vestibulares y las SGN, y en la sección 5 se describen los pasos para el registro de las neuronas después de un período de cultivo. En nuestras manos, la sección 4 y la sección 5 se realizan durante un período de 2 días consecutivos.

Protocol

Todo el uso de animales descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California. Los animales en este protocolo son ratas Long Evans de P3 a P25 de ambos sexos obtenidas de Charles River Laboratories, pero estos métodos se pueden aplicar a otras cepas de roedores. Se debe usar una bata de laboratorio y guantes durante todos los procedimientos, así como gafas protectoras contra salpicaduras cuando se preparan soluciones. …

Representative Results

La ejecución de protocolos de pinza de voltaje mediante la aplicación de familias de pasos de voltaje revela la activación dependiente del voltaje de una variedad de diferentes familias de corrientes. En la Figura 1A,B se muestran ejemplos representativos de corrientes de células enteras evocadas a partir de una VGN y adaptadas de grabaciones publicadas13. La aplicación de voltajes despolarizantes (Figura 1B) activa …

Discussion

Los métodos presentados aquí son específicos para grabaciones de neuronas aisladas; Estudios anteriores se han centrado en grabaciones de terminales axónicos en una preparación semiintacta. En comparación con las técnicas de grabación de terminales existentes, las grabaciones aisladas ofrecen un comportamiento superior de fijación de espacio e isopotencial. Además, este protocolo proporciona acceso a una muestra más amplia de neuronas, ya que solo las subpoblaciones portadoras de cáliz son accesibles en los r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los doctores Jing Bing Xue y Ruth Anne Eatock por sus primeras contribuciones a estos métodos. Este trabajo fue apoyado por NIH NIDCD R03 DC012652 y NIDH NIDCD DC012653S, y R01 DC0155512 a RK y T32 DC009975 a DB, NN y KR.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

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Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

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