Summary

Isoleren en kweken van vestibulaire en spiraalvormige ganglion somata van neonatale knaagdieren voor patch-clamp opnames

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Hier worden methoden gepresenteerd die gedetailleerde instructies geven voor het ontleden, dissociëren, kweken en patch-clamp-opname van vestibulaire ganglion- en spiraalvormige ganglionneuronen van het binnenoor.

Abstract

De compacte morfologie van geïsoleerde en gekweekte ganglionneuronen in het binnenoor maakt gedetailleerde karakteriseringen mogelijk van de ionkanalen en neurotransmitterreceptoren die bijdragen aan de celdiversiteit in deze populatie. Dit protocol schetst de stappen die nodig zijn voor het succesvol ontleden, dissociëren en op korte termijn kweken van de somata van bipolaire neuronen in het binnenoor met het oog op patch-clamp-opnames. Gedetailleerde instructies voor het voorbereiden van vestibulaire ganglionneuronen worden voorzien van de nodige aanpassingen die nodig zijn voor het plateren van spiraalvormige ganglionneuronen. Het protocol bevat instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen in de configuratie met geperforeerde patch. Voorbeeldresultaten die de spanningsklemopnames van hyperpolarisatie-geactiveerde cyclische nucleotide-gated (HCN)-gemedieerde stromen karakteriseren, benadrukken de stabiliteit van de opnameconfiguratie van geperforeerde pleisters in vergelijking met de meer standaard configuratie met gescheurde pleisters. De combinatie van deze methoden, geïsoleerde somata plus geperforeerde-patch-clamp-opnames, kan worden gebruikt om cellulaire processen te bestuderen die lange, stabiele opnames vereisen en het behoud van intracellulair milieu, zoals signalering via G-proteïne gekoppelde receptoren.

Introduction

De bipolaire neuronen van de vestibulocochleaire zenuw verbinden de sensorische haarcellen van het binnenoor met de hersenstam. Zij zijn de belangrijkste dragers van informatie over geluid en hoofdbewegingen; Schade aan deze belangrijke cellen leidt tot doofheid en evenwichtsstoornissen. De vestibulaire en auditieve delen van de zenuw bestaan elk uit verschillende celtypen die morfologisch en functioneel divers zijn 1,2. In het vestibulaire systeem vuren twee afferente subpopulaties spontaan met tussenpozen die regelmatig of onregelmatig zijn2. Afferente piektiming wordt verondersteld een onderliggende diversiteit in ionenkanaalsamenstelling te weerspiegelen 3,4. In het auditieve systeem zijn er twee belangrijke subpopulaties van spiraalvormige ganglionneuronen (SGN’s); Terwijl Type I SGN’s contact maken met individuele binnenste haarcellen5, komen Type II SGN’s in contact met meerdere buitenste haarcellen5. In vitro opnames van semi-intacte en organotypische culturen suggereren verschillen in de membraaneigenschappen van Type I en Type II SGN’s 6,7.

Veel ionkanalen en neurotransmitterreceptoren die aan de uiteinden van deze neuronen worden aangetroffen, worden ook in hun cellichamen aangetroffen. Als zodanig kunnen culturen van de geïsoleerde vestibulaire en de spiraalvormige ganglionsomata in vitro worden bestudeerd om te begrijpen hoe ionkanalen en neurotransmitterreceptoren bijdragen aan de respons van deze neuronen. De compacte morfologie van de geïsoleerde cellichamen maakt elektrische opnames van hoge kwaliteit mogelijk, geschikt voor gedetailleerde karakterisering van spanningsafhankelijke ionkanalen en neurotransmitterreceptoren. Gemakkelijke toegang tot een representatieve verscheidenheid aan neuronsubtypes maakt een high-throughput analyse van celdiversiteit mogelijk.

Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren en kweken van gedissocieerde ganglioncellichamen uit het superieure deel van het vestibulaire ganglion bij ratten op postnatale dag (P)9 tot P20. Er worden ook suggesties gedaan om deze methoden uit te breiden naar het spiraalvormige ganglion, naast de stappen die nodig zijn voor het succesvol extraheren, dissociëren en plateren van de ganglioncellen. Deze methoden zijn een evolutie van de methoden die zijn bedacht in publicaties van verschillende laboratoria 8,9,10. In dit artikel zijn ook richtlijnen opgenomen voor het selecteren van gezonde cellen voor patch-clamp-opnames.

Ten slotte schetst het protocol de procedure voor het opnemen van patch-clamps met behulp van de geperforeerde patchconfiguratie11. Hoewel de configuratie met geperforeerde pleisters tijdrovender en technisch uitdagender is dan de meer gebruikelijke configuratie met gescheurde pleisters, is het beter voor het behoud van het cytoplasmatische milieu dat lange en stabiele opnamesessies mogelijk maakt. De voordelen van deze opnameconfiguratie worden hier geïllustreerd door de verbeterde stabiliteit van hyperpolarisatie-geactiveerde kationische stromen in geperforeerde pleisters ten opzichte van gescheurde pleisteropnamen.

Dit protocol is onderverdeeld in vijf secties. In de paragrafen 1-3 worden oplossingen en hulpmiddelen beschreven die van tevoren kunnen worden voorbereid en opgeslagen. Sectie 4 beschrijft de stappen voor het ontleden en plateren van de vestibulaire en SGN’s. Sectie 5 beschrijft de stappen voor het opnemen van de neuronen na een periode in kweek. In onze handen worden sectie 4 en sectie 5 uitgevoerd over een periode van 2 opeenvolgende dagen.

Protocol

Al het hier beschreven gebruik van dieren is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Southern California. Dieren in dit protocol zijn P3- tot P25-gerijpte Long Evans-ratten van beide geslachten verkregen van Charles River Laboratories, maar deze methoden kunnen worden toegepast op andere knaagdierstammen. Bij alle procedures moeten een laboratoriumjas en handschoenen worden gedragen, evenals een spatbril bij het maken van oplossingen. 1. Voorb…

Representative Results

Het uitvoeren van spanningsklemprotocollen door families van spanningsstappen toe te passen, onthult de spanningsafhankelijke activering van een verscheidenheid aan verschillende stroomfamilies. Representatieve voorbeelden van stromen van hele cellen die worden opgeroepen door een VGN en aangepast zijn aan de hand van gepubliceerde opnames13 worden weergegeven in figuur 1A,B. Het toepassen van depolariserende spanningen (Figuur 1B…

Discussion

De hier gepresenteerde methoden zijn specifiek voor opnames van geïsoleerde neuronen; Eerdere studies hebben zich gericht op opnames van axonterminals in een semi-intact preparaat. In vergelijking met bestaande terminalopnametechnieken bieden geïsoleerde opnames een superieur ruimteklem- en isopotentiaalgedrag. Bovendien biedt dit protocol toegang tot een bredere steekproef van neuronen, aangezien alleen kelkdragende subpopulaties toegankelijk zijn in semi-intacte opnames van de vestibulaire epitheel. Ten slotte maken …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We erkennen Drs. Jing Bing Xue en Ruth Anne Eatock voor hun vroege bijdragen aan deze methoden. Dit werk werd ondersteund door NIH NIDCD R03 DC012652 en NIH NIDCD DC012653S, en R01 DC0155512 naar RK en T32 DC009975 naar DB, NN en KR.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

Play Video

Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

View Video