Summary

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Abstract

A morfologia compacta dos neurônios ganglionares isolados e cultivados da orelha interna permite caracterizações detalhadas dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que contribuem para a diversidade celular nesta população. Este protocolo descreve os passos necessários para o sucesso da dissecação, dissociação e cultura em curto prazo da somata de neurônios bipolares da orelha interna para fins de gravações de patch-clamp. Instruções detalhadas para a preparação dos neurônios do gânglio vestibular são fornecidas com as modificações necessárias para o plaqueamento dos neurônios do gânglio espiral. O protocolo inclui instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras na configuração de patch perfurado. Resultados de exemplo que caracterizam os registros de clamp de tensão de correntes mediadas por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) destacam a estabilidade da configuração de gravação de patch perfurado em comparação com a configuração mais padrão de patch rompido. A combinação desses métodos, somata isolada mais registros perfurados de patch-clamp, pode ser usada para estudar processos celulares que requerem registros longos e estáveis e a preservação do meio intracelular, como a sinalização através de receptores acoplados à proteína G.

Introduction

Os neurônios bipolares do nervo vestibulococlear conectam as células ciliadas sensoriais da orelha interna ao tronco encefálico. São os principais portadores de informações sobre sons e movimentos da cabeça; Danos a essas células importantes levam à surdez e distúrbios do equilíbrio. As porções vestibular e auditiva do nervo são compostas, cada uma, por tipos celulares distintos e morfologicamentediversos1,2. No sistema vestibular, duas subpopulações aferentes disparam espontaneamente em intervalos regulares ouirregulares2. Acredita-se que o tempo da espícula aferente reflita uma diversidade subjacente na composição dos canaisiônicos 3,4. No sistema auditivo, existem duas subpopulações principais de neurônios do gânglio espiral (GNG); enquanto os GNC Tipo I entram em contato com células ciliadas internas individuais5, os GNs Tipo II entram em contato com múltiplas células ciliadas externas5. Registros in vitro de culturas semi-intactas e organotípicas sugerem diferenças nas propriedades de membrana dos SGNs Tipo I e TipoII 6,7.

Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores encontrados nos terminais desses neurônios também são encontrados em seus corpos celulares. Dessa forma, culturas do somato vestibular isolado e do gânglio espiral podem ser estudadas in vitro para entender como canais iônicos e receptores de neurotransmissores contribuem para a resposta desses neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares isolados permite registros elétricos de alta qualidade, adequados para a caracterização detalhada de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores de neurotransmissores. O fácil acesso a uma variedade representativa de subtipos de neurônios permite a análise de alto rendimento da diversidade celular.

Este artigo apresenta um método para isolar e cultivar corpos de células ganglionares dissociadas da porção superior do gânglio vestibular em ratos no dia pós-natal (P)9 a P20. Também são apresentadas sugestões para estender esses métodos ao gânglio espiral, além das etapas necessárias para extrair, dissociar e plaquear com sucesso as células ganglionares. Esses métodos são uma evolução daqueles desenvolvidos em publicações de diversos laboratórios8,9,10. Também está incluída neste artigo a orientação para a seleção de células saudáveis para gravações de patch-clamp.

Finalmente, o protocolo descreve o procedimento para o registro de patch-clamp usando a configuração de patch perfurado11. Embora a configuração de patch perfurado seja mais demorada e tecnicamente mais desafiadora do que a configuração de patch rompido mais comum, ela é melhor para manter o meio citoplasmático que permite sessões de gravação longas e estáveis. Os benefícios dessa configuração de gravação são ilustrados aqui através da estabilidade melhorada das correntes catiônicas ativadas por hiperpolarização em remendo-perfurado em relação aos registros de mancha-rompida.

Este protocolo está organizado em cinco seções. As seções 1 a 3 descrevem soluções e ferramentas que podem ser preparadas e armazenadas com antecedência. A seção 4 descreve os passos para dissecar e plaquear os vestibulares e SGNs. A seção 5 descreve os passos para o registro dos neurônios após um período em cultura. Em nossas mãos, a seção 4 e a seção 5 são realizadas durante um período de 2 dias consecutivos.

Protocol

Todo o uso de animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul da Califórnia. Os animais deste protocolo são ratos Long Evans de ambos os sexos com idade P3 a P25 obtidos do Charles River Laboratories, mas estes métodos podem ser aplicados a outras linhagens de roedores. Um jaleco de laboratório e luvas devem ser usados durante todos os procedimentos, bem como óculos de proteção contra respingos ao fazer soluções. …

Representative Results

A execução de protocolos de fixação de tensão através da aplicação de famílias de passos de tensão revela a ativação dependente de tensão de uma variedade de diferentes famílias de correntes. Exemplos representativos de correntes de células inteiras evocadas a partir de um VGN e adaptadas de registros publicados13 são mostrados na Figura 1A,B. A aplicação de tensões despolarizantes (Figura 1B) ativa uma…

Discussion

Os métodos aqui apresentados são específicos para registros de neurônios isolados; Estudos anteriores se concentraram em gravações de terminais de axônio em uma preparação semi-intacta. Quando comparados com as técnicas de gravação de terminais existentes, os registros isolados oferecem um comportamento de pinça espacial e isopotencial superior. Além disso, esse protocolo fornece acesso a uma amostra mais ampla de neurônios, uma vez que apenas subpopulações portadoras de cálice são acessíveis em regis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos Drs. Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock por suas primeiras contribuições a esses métodos. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 para RK e T32 DC009975 para DB, NN e KR.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

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Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

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