Summary

Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Abstract

La morphologie compacte des neurones ganglionnaires de l’oreille interne isolés et cultivés permet de caractériser en détail les canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs qui contribuent à la diversité cellulaire au sein de cette population. Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la dissection, à la dissociation et à la culture à court terme réussies des somata des neurones bipolaires de l’oreille interne à des fins d’enregistrements patch-clamp. Des instructions détaillées pour la préparation des neurones ganglionnaires vestibulaires sont fournies avec les modifications nécessaires nécessaires au placage des neurones ganglionnaires spiralés. Le protocole comprend des instructions pour effectuer des enregistrements de patch-clamp de cellules entières dans la configuration de patch perforé. Des exemples de résultats caractérisant les enregistrements par pince de tension de courants cycliques activés par hyperpolarisation et dépendants des nucléotides (HCN) mettent en évidence la stabilité de la configuration d’enregistrement de patch perforé par rapport à la configuration plus standard de patch rompu. La combinaison de ces méthodes, somata isolée et enregistrements perforés-patch-clamp, peut être utilisée pour étudier les processus cellulaires qui nécessitent des enregistrements longs et stables et la préservation du milieu intracellulaire, tels que la signalisation par des récepteurs couplés aux protéines G.

Introduction

Les neurones bipolaires du nerf vestibulocochléaire relient les cellules ciliées sensorielles de l’oreille interne au tronc cérébral. Ils sont les principaux vecteurs d’informations sur le son et les mouvements de la tête ; Les dommages causés à ces cellules importantes entraînent une surdité et des troubles de l’équilibre. Les parties vestibulaire et auditive du nerf sont chacune composées de types cellulaires distincts qui sont morphologiquement et fonctionnellement diversifiés 1,2. Dans le système vestibulaire, deux sous-populations afférentes se déclenchent spontanément à des intervalles réguliers ou irréguliers2. On pense que la synchronisation des pics afférents reflète une diversité sous-jacente dans la composition des canaux ioniques 3,4. Dans le système auditif, il existe deux sous-populations principales de neurones ganglionnaires spiralés (SGN) ; alors que les SGN de type I entrent en contact avec des cellules ciliées internes individuelles5, les SGN de type II entrent en contact avec plusieurs cellules ciliées externes5. Des enregistrements in vitro de cultures semi-intactes et organotypiques suggèrent des différences dans les propriétés membranaires des SGN de type I et de type II 6,7.

De nombreux canaux ioniques et récepteurs de neurotransmetteurs situés aux extrémités de ces neurones se trouvent également dans leurs corps cellulaires. Ainsi, les cultures du somata vestibulaire isolé et du somata ganglionnaire spiral peuvent être étudiées in vitro pour comprendre comment les canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs contribuent à la réponse de ces neurones. La morphologie compacte des corps cellulaires isolés permet des enregistrements électriques de haute qualité, adaptés à la caractérisation détaillée des canaux ioniques voltage-dépendants et des récepteurs des neurotransmetteurs. L’accès facile à une variété représentative de sous-types de neurones permet une analyse à haut débit de la diversité cellulaire.

Cet article présente une méthode d’isolement et de culture des corps cellulaires ganglionnaires dissociés de la partie supérieure du ganglion vestibulaire chez le rat au jour postnatal (P)9 à P20. Des suggestions sont également fournies pour étendre ces méthodes au ganglion spiralé, en plus des étapes nécessaires pour extraire, dissocier et plaquer avec succès les cellules ganglionnaires. Ces méthodes sont une évolution de celles mises au point dans les publications de divers laboratoires 8,9,10. Ce document contient également des conseils pour la sélection de cellules saines pour les enregistrements patch-clamp.

Enfin, le protocole décrit la procédure d’enregistrement des patch-clamps à l’aide de la configuration des patchs perforés11. Bien que la configuration du patch perforé soit plus longue et plus difficile techniquement que la configuration plus courante du patch rompu, elle est préférable pour maintenir le milieu cytoplasmique qui permet des sessions d’enregistrement longues et stables. Les avantages de cette configuration d’enregistrement sont illustrés ici par l’amélioration de la stabilité des courants cationiques activés par l’hyperpolarisation dans les enregistrements en patch perforé par rapport aux enregistrements en patch rompu.

Ce protocole est organisé en cinq sections. Les sections 1 à 3 décrivent les solutions et les outils qui peuvent être préparés et stockés à l’avance. La section 4 décrit les étapes de dissection et de placage du vestibulaire et des SGN. La section 5 décrit les étapes de l’enregistrement des neurones après une période de culture. Entre nos mains, la section 4 et la section 5 sont effectuées sur une période de 2 jours consécutifs.

Protocol

Toute utilisation animale décrite ici a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie du Sud. Les animaux de ce protocole sont des rats Long Evans des deux sexes âgés de P3 à P25 obtenus auprès des laboratoires Charles River, mais ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres souches de rongeurs. Une blouse de laboratoire et des gants doivent être portés pendant toutes les procédures, ainsi que des lunettes de protection contre…

Representative Results

L’exécution de protocoles de pince de tension en appliquant des familles de pas de tension révèle l’activation dépendante de la tension d’une variété de familles de courants différentes. Des exemples représentatifs de courants de cellules entières évoqués à partir d’un VGN et adaptés d’enregistrements publiés13 sont présentés à la figure 1A,B. L’application de tensions dépolarisantes (Figure 1B</stron…

Discussion

Les méthodes présentées ici sont spécifiques aux enregistrements de neurones isolés ; Des études antérieures se sont concentrées sur des enregistrements à partir de terminaisons axonales dans une préparation semi-intacte. Par rapport aux techniques d’enregistrement terminales existantes, les enregistrements isolés offrent un comportement supérieur en termes de pince d’espace et d’isopotentiel. De plus, ce protocole permet d’accéder à un échantillon plus large de neurones, puisque seules les sous-po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les Drs Jing Bing Xue et Ruth Anne Eatock pour leurs premières contributions à ces méthodes. Ce travail a été soutenu par NIH NIDCD R03 DC012652 et NIH NIDCD DC012653S, et R01 DC0155512 à RK et T32 DC009975 à DB, NN et KR.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

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Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

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