Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.
Aynı doku kesitinde birden fazla epitopu sırayla tespit eden oligonükleotidlerle antikor barkodlaması kullanan çoklanmış görüntüleme teknolojisi, tümör mikroçevresinin anlaşılmasını geliştiren tümör değerlendirmesi için etkili bir metodolojidir. Formalin sabit, parafin gömülü dokularda protein ekspresyonunun görselleştirilmesi, spesifik bir floroforun tamamlayıcı oligonükleotidler aracılığıyla antikora bağlı bir barkoda tavlanması ve daha sonra örnek görüntüleme yapılması ile elde edilir; Gerçekten de, bu yöntem, tek bir doku boyama reaksiyonunda 40’tan fazla antikorun özelleştirilebilir panellerinin kullanılmasına izin verir. Bu yöntem, taze dondurulmuş doku, formalin sabit, parafin gömülü doku, kültürlenmiş hücreler ve periferik kan mononükleer hücreleri ile uyumludur, bu da araştırmacıların bu teknolojiyi tek hücreli çözünürlükte çeşitli numune türlerini görüntülemek için kullanabilecekleri anlamına gelir. Bu yöntem manuel boyama ve sabitleme protokolü ile başlar ve tüm antikor barkodları bir antikor kokteyli kullanılarak uygulanır. Boyama akışkanları cihazı tamamen otomatiktir ve tüm biyobelirteçler standart bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenene kadar spektral olarak farklı floroforları etiketleme, görüntüleme ve çıkarma yinelemeli döngülerini gerçekleştirir. Görüntüler daha sonra tüm belirteçler için tek hücreli çözünürlük elde etmek üzere tüm görüntüleme döngüleri boyunca toplanır ve derlenir. Tek adımlı boyama ve nazik florofor giderimi, sadece yüksek oranda çoğullanmış biyobelirteç analizine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda istenirse ek çıkış yönü analizi için numuneyi korur (örneğin, hematoksilin ve eozin boyama). Ayrıca, görüntü analiz yazılımı, görüntü işleme-sürüklenme telafisi, arka plan çıkarma, hücre segmentasyonu ve kümelemenin yanı sıra uzamsal ağ haritalarının oluşturulması için görüntülerin ve hücre fenotiplerinin görselleştirilmesini ve analizini sağlar. Özetle, bu teknoloji, dokuya bağlı, oligonükleotid konjuge antikorlara tamamlayıcı olan floresan olarak etiketlenmiş DNA problarını yinelemeli olarak hibritize etmek, görüntülemek ve şeritlemek için bilgisayarlı bir mikroakışkan sistemi ve floresan mikroskobu kullanır.
Tümör mikroçevresi (TME), tümör hücreleri, tümör stromal hücreleri, bağışıklık hücreleri, hücre dışı matriksin hücresel olmayan bileşenleri ve tümör, stromal ve bağışıklık hücreleri tarafından üretilen ve salınan çok sayıda bol molekülden oluşan son derece heterojendir 1,2. Biriken kanıtlar, TME’nin tümör farklılaşması, büyümesi, invazyonu, metastazı ve tedavilere yanıtının yeniden programlanmasında çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir3.
TME’deki farklı hücre tiplerinin sinyal ağları aracılığıyla birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve iletişim kurduğunu anlamak, kanser teşhisini iyileştirmek, immünoterapiyi optimize etmek ve yeni tedaviler geliştirmek için gereklidir4. İmmünohistokimya (IHC) ve immünofloresan (IF) dahil olmak üzere geleneksel doku mikroskobu teknikleri, tümör örneklerinde hücre tiplerini, bolluğunu ve iletişimini incelemek için on yıllardır kullanılmaktadır. Ne yazık ki, bu teknikler tipik olarak bir doku kesitinde sadece bir veya iki protein belirtecini değerlendirebilir ve bu hücreler arasındaki karmaşık mekansal ve yapısal ilişkileri ortaya koyamaz 5,8,7.
Son yirmi yılda, birkaç çoğullanmış görüntüleme teknolojisi kurulmuştur8. Bu teknolojiler, TME içindeki bağışıklık hücrelerinin bileşimi, işlevi ve konumu hakkında çok daha gelişmiş görünümler sunarak, karmaşık TME’leri tek hücre düzeyinde 9,10’da tanımlama ve mekansal olarak profilleme yeteneğinde hızlı ilerlemelere yol açmaktadır. TME’deki çeşitli tümör ve immün hücrelerin mekansal ve yapısal ilişkileri, günümüzde bu çoklanmış görüntüleme teknolojilerinin kullanıldığı biyolojik ve klinik çalışmaların ön saflarında yer almaktadır11,12.
Oligonükleotid konjuge antikor barkodlaması kullanılarak yakın zamanda geliştirilen çoklanmış görüntüleme teknolojisi, formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örneklerde oligonükleotid konjuge antikorların saptanmasına dayanan etkili bir tek hücreli biyolojik araştırma platformudur13,14. Şu anda, bu çoklanmış görüntüleme teknolojisi, tek bir doku bölüm15’te 100’den fazla belirtecin aynı anda görüntülenmesine izin vermekte ve bu da in situ olarak ayırt edilebilen hücre tiplerinin sayısını arttırmaktadır. Bu, geleneksel immünofenotipleme yaklaşımları kullanılarak mümkün olmayan tümör ve bağışıklık hücrelerinin mekansal analizini sağlar16.
Burada, oligonükleotidlere karşı saflaştırılmış antikorların konjuge edilmesi ve bu konjugasyonun çoklanmış görüntüleme platformu ve FFPE dokusu ile çok döngülü bir görüntüleme prosedürü kullanılarak doğrulanması için optimize edilmiş bir protokol tanımlanmıştır. Ayrıca, bu teknoloji ile kullanılan temel görüntü işleme ve veri analizi prosedürlerini açıklıyoruz.
TME, kanser gelişimi, ilerlemesi ve tedavi yanıtlarında önemli bir rol oynar. Ek olarak, TME’deki spesifik tümör infiltrasyonu yapan lenfosit alt gruplarının yoğunluğu, belirli kanser türleri için prognostik bir biyobelirteç görevi görebilir. Dikkat çekici bir şekilde, TME’nin hücresel bileşimine ek olarak, bir tümörün mekansal özellikleri, tümörün biyolojisini anlamak ve potansiyel prognostik biyobelirteçleri tanımlamak için bir taslak sağlayabilir12,17.
Çok sayıda bağışıklık hücresi popülasyonu prokanser veya antikanser yanıtlarına dahil olduğundan, bu hücrelerin ve birbirleriyle ve kanser hücreleriyle mekansal ilişkilerinin daha iyi anlaşılması, yeni immünoterapötik stratejilerin tanımlanmasına rehberlik edecektir. Önceki çalışmalar, TME hücrelerinin yerini ve mekansal dağılımını, intratümöral ve peritümöral alanlardaki doku yapısına ve tümör hücrelerinin invaziv sınırlarına göre tabakalaştırmıştır18,19. Son 15 yılda, teknolojik gelişmeler, bireysel hücrelerin mekansal dağılımlarına dayanan fenotipik analizini, TME’yi incelemek ve tümör immünoterapisi için potansiyel biyobelirteçleri kategorize etmek için yeni, etkili bir araç haline getirmiştir. Multipleks IF histokimyası aynı anda birden fazla biyolojik belirteci tahmin edebilir20.
Oligonükleotid konjuge antikor stratejisine benzer şekilde, TME’yi incelemek için dört tip protein bazlı multipleks platform kullanılır: kromojen, floresan, DNA barkodu ve metal izotop etiketli antikor tespit sistemleri. Uygun maliyetli kromojenik IHC platformları, geleneksel parlak alan mikroskobu kullanarak tüm slaytların görüntülenmesini ve patolojik değerlendirmeyi mümkün kılar. Çok katlı IF ve IHC’de, floroforlarla konjuge edilmiş antikorlar kullanılır. Multipleks IF/IHC platformu, yüksek özgüllüğe sahip antikorları tespit eder ve hücre altı seviye 6,21’de bile hedeflenen antikorları ölçebilir. Ek olarak, kromojenlerin ve floroforların doğası gereği, bir antikor panelinin kullanılması, tek bir slaytta 10 adede kadar biyobelirtecin ekspresyonunu yakalayabilir. Metal izotop bazlı platformlarda, metal etiketli antikorlar, tek hücreli ve uzamsal çözünürlükte çoklanmış görüntüleme yapmak için kullanılır ve bireysel doku bölümleri için yüksek hassasiyet gösterir22. Teorik olarak, bu metal konjuge antikor yaklaşımları, tek bir doku kesitinde 100’den fazla biyobelirtecin aynı anda tespit edilmesini sağlar. İzotop etiketleme tekniğinin bir zorluğu, zenginleştirmenin% 100 saflığına ulaşılmasını önleyen izobarik girişimdir23. Ayrıca, belirteçlerin sayısı arttıkça girişim de artar. DNA konjuge antikor tespit platformları, benzersiz DNA barkodlarıyla etiketlenmiş antikorları tanır. Bu platformlarda 40’tan fazla biyobelirteç aynı anda yüksek özgüllükle yakalanabilir6.
Multipleks görüntüleme, DNA konjuge antikorları tek bir adımda tek bir doku slaytına uygulamak için ticari olarak temin edilebilen DNA barkod etiketli bir antikor tespit platformudur (Şekil 8). Doku hazırlama aşaması için, üreticilerden elde edilen altın kaplı slaytların kullanılmasını gerektiren çoklanmış iyon ışını görüntüleme platformunun aksine, çoklanmış görüntüleme platformu, dokunun yapışmasına yardımcı olmak ve boyama ve görüntüleme işlemi sırasında dokuyu sağlam tutmak için% 0.1 poli-L-lizin ile kaplanmış sadece normal kapaklar veya slaytlar gerektirir. Lekelenmeden sonraki 4 hafta içinde kapak kapaklarında doku kesitlerinin kullanılması tavsiye edilir, çünkü lekesiz slaytların uzun süre depolanması antijenitenin azalmasına neden olur. Lekeli bir kapak kayması numunesi, lekelenme sinyalini kaybetmeden 2 haftaya kadar 4 °C’de depolama tamponunda tutulabilir. Kapak kayması numunelerinin saklanması için özel bir ekipman gerekmez. Çok katlı görüntüleme sistemi, daha büyük dokuların boyanmasını ve kolay kullanımını sağlayan kapak kaymaları yerine normal slaytlar kullanacak şekilde yükseltilmiştir. Antikor konjugasyonu için bir indirgeme çözeltisi kullanıldığında (adım 3.2.3), antikorların zarar görmesini önlemek için reaksiyon en fazla 30 dakika ile sınırlandırılmalıdır. Adım 5.6.6’daki bloke edici tamponlar yeni hazırlanmalı ve bloke edici tamponlar tekrar kullanılmamalıdır.
Kromojen, floresan ve metal izotop etiketli multipleks antikor tespit platformlarıyla karşılaştırıldığında, çoğullanmış görüntüleme teknolojisinin bazı avantajları vardır. Örneğin, çoklanmış görüntüleme için önceden tasarlanmış 60’tan fazla antikor paneli ticari olarak temin edilebilir, bu da antikor konjugasyonu ve validasyonunda zamandan ve maliyetten tasarruf etmenize yardımcı olur ve önceden tasarlanmış antikor panellerinin sayısı artmaktadır. Karsinom belirteci pan-sitokeratin, melanom belirteci SOX10, vasküler belirteç CD31, stromal belirteç SMA ve çok sayıda immün hücre belirtecini içeren bu antikorlar doğrulanır ve deneye hazırdır. Önceden tasarlanmamış antikorlar için, çoklanmış görüntüleme ile kullanılmak üzere tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen konjugasyon kiti basit ve kullanıcı dostudur. Müşteri konjuge antikorları 4 °C’de depolandığında 1 yıl boyunca iyidir. Ek olarak, görüntüleri yakalamak için makinenin ısınması gerekli değildir. Bu çoklanmış görüntüleme teknolojisinde, görüntü elde etmedeki yinelemeli yıkama, hibridizasyon ve sıyırma adımları nadiren belirteç yoğunluğunun azalmasına veya doku morfolojisinin bozulmasına neden olur 5,24,25. Ayrıca, kompozit görüntüler basit bir üç renkli floresan mikroskobu ile QPTIFF formatında yakalanır ve üçüncü taraf dijital analiz yazılımı kullanılarak yüklenebilir ve analiz edilebilir. Boyama belirteçleri tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilebilir ve hücre fenotipleri, belirteçlerin birlikte lokalizasyonu yoluyla karakterize edilebilir (Şekil 6 ve Şekil 7). Çok katlı bir görüntünün kapsamlı analizi, doku bölmelerini, tek hücreli belirteç miktarını ve en yakın komşu ve yakınlık verilerini daha da ortaya koymaktadır (Şekil 8).
Çoğullanmış görüntü analizindeki bir zorluk, hücre tipi tanımlamadır. Genellikle, bir görüntüye daha fazla tek nesneli sınıflandırıcı uygulandığında, daha nadir görülen fenotiplere açıklama eklenir. Bu nedenle, aynı sınıflandırıcıda birlikte ifade edilmeyen bilinen belirteçlerin kullanılması ve tek hücrelerin ek açıklamasına yalnızca fenotiple ilgili sınıflandırıcının uygulanması önerilir. Hücre tipi ek açıklamasındaki değişiklikler, hücre uzamsal dağılımındaki farklılıklar ve hücresel komşuluk analizi26,27 gibi önemli ölçüde farklı uzamsal sonuçlarla sonuçlanacaktır.
Çok katlı görüntü analizinin, FFPE dokusu, taze dondurulmuş doku, arşivlenmiş bütün slaytlar ve doku mikrodizileri dahil olmak üzere birçok numune türünün boyanmasında ve görüntülenmesinde başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Meme, beyin, akciğer, dalak, böbrek, lenf nodu ve deri dokusu kesitlerinin çoğullanmış görüntüleri derin tek hücreli uzamsal fenotipleme verileri ile elde edilebilir 5,16,25,28.
Gelecekte, çoğullanmış görüntüleme için daha önceden tasarlanmış antikorlar beklenmektedir. Ek olarak, çoğullanmış görüntü analizi için özel yazılımların geliştirilmesine büyük ihtiyaç vardır. Şu anda, Hi-Plex görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen ve açık kaynaklı birçok yazılım programı mevcuttur29, ancak bilim adamlarının bu analizler için standart bir iş akışı oluşturmada hala yardıma ihtiyaçları vardır30,31. Bu protokol kullanılarak yakalanan bileşik görüntüler üçüncü taraf yazılımlarla uyumlu olsa da, bu durum kullanıcı için ek maliyetlere neden olabilir. Çoklanmış görüntüleme teknolojisinin bir diğer dezavantajı, yinelemeli yıkama, hibridizasyon ve büyük antikor panelleriyle sıyırma işleminden sonra nükleer protein algılamasında sinyal azalmasıdır. Neyse ki, muhabir plakalarını tasarlarken barkodlu floroforların erken döngülerde alınmasıyla bu en aza indirilebilir. Son zamanlarda, bu platform, kompozit görüntüler elde etme süresini önemli ölçüde azaltan yeni bir yüksek hızlı tarama sistemi ile yükseltildi32. Ek olarak, tiramid-konjuge barkodların kullanıldığı yeni bir stratejinin, oligonükleotid konjuge antikor barkodlama tabanlı görüntülemeyi geliştirdiği bildirilmiştir. Bu teknoloji, barkod konjuge antikorların elde edilmesinin zor olduğu boyama sinyallerini yükseltmeyi amaçlamaktadır33.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu makaleyi düzenledikleri için Düzenleme Hizmetleri’nden Donald R. Norwood’a, MD Anderson’daki Araştırma Tıp Kütüphanesi’ne ve MD Anderson’daki Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü’ndeki multipleks IF ve görüntü analiz laboratuvarına teşekkür eder. Bu proje kısmen Translasyonel Moleküler Patoloji-İmmünoprofiling laboratuvarı (TMP-IL) Moonshots Platformu, Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi ve NCI İşbirliği Anlaşması U24CA224285 (MD Anderson Kanser Merkezi CIMAC’a) tarafından desteklenmiştir.
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |