多路复用条形码图像分析最近改进了肿瘤微环境的表征,允许对细胞组成、功能状态和细胞间相互作用进行全面研究。在此,我们描述了使用寡核苷酸偶联抗体的条形码和循环成像的染色和成像方案,其允许使用高维图像分析技术。
使用抗体条形码和寡核苷酸的多重成像技术,可依次检测同一组织切片中的多个表位,是一种有效的肿瘤评估方法,可提高对肿瘤微环境的理解。当特定的荧光团通过互补寡核苷酸 退 火到抗体结合的条形码上,然后进行样品成像时,可以实现福尔马林固定石蜡包埋组织中蛋白质表达的可视化;实际上,该方法允许在单个组织染色反应中使用40多种抗体的可定制组合。该方法与新鲜冷冻组织、福尔马林固定、石蜡包埋组织、培养细胞和外周血单核细胞兼容,这意味着研究人员可以使用该技术以单细胞分辨率查看各种样品类型。该方法从手动染色和固定方案开始,并使用抗体混合物应用所有抗体条形码。染色流体仪器是全自动的,可执行标记、成像和去除光谱不同的荧光团的迭代循环,直到使用标准荧光显微镜对所有生物标志物进行成像。然后在所有成像周期中收集和编译图像,以实现所有标记物的单细胞分辨率。一步染色和温和的荧光团去除不仅允许高度多重的生物标志物分析,而且如果需要,还可以保存样品以进行额外的下游分析(例如,苏木精和伊红染色)。此外,图像分析软件支持图像处理漂移补偿、背景减法、细胞分割和聚类,以及图像和细胞表型的可视化和分析,以生成空间网络图。总之,该技术采用计算机化的微流体系统和荧光显微镜来迭代杂交、成像和剥离荧光标记的DNA探针,这些探针与组织结合的寡核苷酸偶联抗体互补。
肿瘤微环境(TME)具有极强的异质性,由肿瘤细胞、肿瘤基质细胞、免疫细胞、细胞外基质的非细胞成分以及肿瘤、基质和免疫细胞产生和释放的众多丰富分子组成1,2。越来越多的证据表明,TME在重新编程肿瘤分化、生长、侵袭、转移和对治疗的反应中具有关键作用3。
了解TME中不同细胞类型如何通过信号网络相互作用和相互通信对于改善癌症诊断,优化免疫疗法和开发新疗法至关重要4。传统的组织显微镜技术,包括免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF),几十年来一直用于研究肿瘤样本中的细胞类型、丰度和通讯。不幸的是,这些技术通常只能评估组织切片中的一个或两个蛋白质标记物,并且不能揭示这些细胞之间复杂的空间和结构关系5,8,7。
在过去的二十年中,已经建立了几种多路复用成像技术8。这些技术大大改善了TME中免疫细胞的组成,功能和位置,从而在单细胞水平上识别和空间分析复杂TME的能力迅速提高9,10。TME中各种肿瘤和免疫细胞的空间和结构关系现在处于使用这些多重成像技术的生物学和临床研究的最前沿11,12。
最近开发的使用寡核苷酸偶联抗体条形码的多重成像技术是一个有影响力的单细胞生物学研究平台,基于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品中寡核苷酸偶联抗体的检测13,14。目前,这种多重成像技术允许在单个组织切片15中同时对100多个标记物进行成像,这增加了原位可区分的细胞类型的数量。这使得使用传统的免疫表型方法无法对肿瘤和免疫细胞进行一定程度的空间分析16。
在本文中,我们描述了一种优化的方案,用于将纯化的抗体偶联到寡核苷酸,并使用多重成像平台和FFPE组织的多周期成像程序验证该偶联。此外,我们还描述了该技术使用的基本图像处理和数据分析程序。
TME在癌症的发展、进展和治疗反应中起着至关重要的作用。此外,TME中特定肿瘤浸润淋巴细胞亚群的密度可以作为某些类型癌症的预后生物标志物。值得注意的是,除了TME的细胞组成外,肿瘤的空间特征还可以为理解肿瘤的生物学和识别潜在的预后生物标志物提供轮廓12,17。
由于许多免疫细胞群参与前癌或抗癌反应,更好地了解这些细胞及其彼此之间以及与癌细胞的空间关系将有助于指导新的免疫治疗策略的鉴定。以前的研究已经根据肿瘤内和肿瘤周围区域的组织结构以及肿瘤细胞的侵袭性边缘对TME细胞的位置和空间分布进行了分层18,19。在过去的15年中,技术进步使基于空间扩散的单个细胞的表型分析成为研究TME和对肿瘤免疫治疗的潜在生物标志物进行分类的新颖而有影响力的工具。多重IF组织化学可以同时估计多个生物标志物20。
与寡核苷酸偶联抗体策略类似,四种基于蛋白质的多重平台用于研究TME:显色原、荧光、DNA条形码和金属同位素标记的抗体检测系统。具有成本效益的显色IHC平台通过使用传统的明场显微镜实现全玻片可视化和病理评估。在多重IF和IHC中,使用与荧光团偶联的抗体。多重IF/IHC平台可检测具有高特异性的抗体,甚至可以在亚细胞水平上定量靶向抗体6,21。此外,由于显色原和荧光团的性质,使用一个抗体组合可以在一张载玻片上捕获多达10个生物标志物的表达。在基于金属同位素的平台上,金属标记抗体用于执行具有单细胞和空间分辨率的多重成像,以及对单个组织切片的高灵敏度22。从理论上讲,这些金属偶联抗体方法能够在单个组织切片上同时检测100多个生物标志物。同位素标记技术的一个挑战是同量异位干扰,它阻止了达到100%的富集纯度23。此外,干扰随着标记数量的增加而增加。DNA偶联抗体检测平台可识别用唯一DNA条形码标记的抗体。在这些平台上可以同时捕获40多种高特异性的生物标志物6。
多重成像是一种市售的 DNA 条形码标记抗体检测平台,用于一步将 DNA 偶联抗体应用于单个组织载玻片(图 8)。对于组织制备阶段,与需要使用从制造商处获得的镀金玻片的多重离子束成像平台不同,多重成像平台只需要常规的盖玻片或涂有0.1%聚-L-赖氨酸的载玻片,以帮助组织粘附在其上并在染色和成像过程中保持组织完整。建议在切片后 4 周内在盖玻片上使用组织切片,因为长期存放未染色的载玻片会导致抗原性降低。染色的盖玻片样品可以在4°C的储存缓冲液中保持长达2周,而不会丢失其染色信号。无需特殊设备即可储存盖玻片样品。多重成像系统已升级为使用常规载玻片代替盖玻片,从而可以对较大的组织进行染色并易于处理。当使用还原溶液进行抗体偶联(步骤3.2.3)时,反应应限制在不超过30分钟,以防止对抗体的损害。步骤5.6.6中的封闭缓冲液应新鲜制备,封闭缓冲液不得重复使用。
与显色、荧光和金属同位素标记的多重抗体检测平台相比,多重成像技术具有一定的优势。例如,市场上有60多种用于多重成像的预设计抗体组合,这有助于节省抗体偶联和验证的时间和成本,并且预先设计的抗体组合的数量正在增长。这些抗体包括癌标志物全细胞角蛋白、黑色素瘤标志物SOX10、血管标志物CD31、基质标志物SMA和许多免疫细胞标志物,已经过验证并做好实验准备。对于未预先设计的抗体,设计用于多重成像的市售偶联试剂盒简单易用。客户偶联的抗体在4°C下储存时可保存1年。 此外,捕获图像不需要机器预热。在这种多重成像技术中,图像采集中的迭代洗涤、杂交和剥离步骤很少导致标记物强度降低或组织形态退化5,24,25。此外,使用简单的三色荧光显微镜以QPTIFF格式捕获合成图像,并可以使用第三方数字分析软件上传和分析。染色标记物可以在单细胞分辨率下可视化,并且可以通过标记物的共定位来表征细胞表型(图6和图7)。对多路复用图像的综合分析进一步揭示了组织区室、单细胞标志物定量以及最近邻和邻近数据(图 8)。
多重图像分析的一个挑战是细胞类型鉴定。通常,当将更多单对象分类器应用于图像时,将注释更多不常见的表型。因此,建议使用不在同一分类器中共表达的已知标记,并仅将表型相关分类器应用于单个细胞的注释。细胞类型注释的变化将导致实质性不同的空间结果,例如细胞空间分布和细胞邻域分析的差异26,27。
多重图像分析已被证明可成功对多种样品类型进行染色和成像,包括FFPE组织、新鲜冷冻组织、存档的全玻片和组织微阵列。可以使用深度单细胞空间表型数据获取乳房、脑、肺、脾脏、肾脏、淋巴结和皮肤组织切片的多路复用图像 5,16,25,28。
未来,预计会有更多用于多重成像的预设计抗体。此外,非常需要开发用于多路复用图像分析的特定软件。目前,存在许多用于Hi-Plex图像分析的商用开源软件程序29,但科学家仍然需要帮助为这些分析创建标准工作流程30,31。尽管使用此协议捕获的合成图像与第三方软件兼容,但这可能会导致用户产生额外费用。多重成像技术的另一个缺点是,在用大抗体组合进行迭代洗涤、杂交和剥离后,核蛋白检测中的信号减少。幸运的是,在设计报告板时,通过在早期周期中检索条形码荧光团,可以最大限度地减少这种情况。最近,该平台升级了一个新的高速扫描系统,大大减少了获取合成图像的时间32。此外,据报道,一种使用酪胺偶联条形码的新策略可以增强寡核苷酸偶联抗体条形码的成像。该技术旨在放大难以获得条形码偶联抗体的染色信号33。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢MD安德森研究医学图书馆编辑服务的Donald R. Norwood编辑本文以及MD安德森转化分子病理学系的多重IF和图像分析实验室。该项目得到了德克萨斯大学MD安德森癌症中心转化分子病理学系的转化分子病理学-免疫分析实验室(TMP-IL)登月平台和NCI合作协议U24CA224285(MD安德森癌症中心CIMAC)的部分支持。
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |