A análise de imagens multiplexadas com código de barras tem melhorado recentemente a caracterização do microambiente tumoral, permitindo estudos abrangentes da composição celular, estado funcional e interações célula-célula. Neste artigo, descrevemos um protocolo de coloração e imagem usando o código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos e imagens cíclicas, que permite o uso de uma técnica de análise de imagens de alta dimensão.
A tecnologia de imagem multiplexada usando código de barras de anticorpos com oligonucleotídeos, que detecta sequencialmente múltiplos epítopos no mesmo corte de tecido, é uma metodologia eficaz para avaliação tumoral que melhora a compreensão do microambiente tumoral. A visualização da expressão de proteínas em tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina é obtida quando um fluoróforo específico é recozido em um código de barras ligado a anticorpos via oligonucleotídeos complementares e, em seguida, imagens de amostras são realizadas; De fato, esse método permite o uso de painéis personalizáveis de mais de 40 anticorpos em uma única reação de coloração de tecido. Este método é compatível com tecido fresco congelado, tecido fixado em formalina, tecido embebido em parafina, células cultivadas e células mononucleares do sangue periférico, o que significa que os pesquisadores podem usar essa tecnologia para visualizar uma variedade de tipos de amostra em resolução de célula única. Este método começa com um protocolo manual de coloração e fixação, e todos os códigos de barras de anticorpos são aplicados usando um coquetel de anticorpos. O instrumento de coloração fluídica é totalmente automatizado e realiza ciclos iterativos de marcação, geração de imagens e remoção de fluoróforos espectralmente distintos até que todos os biomarcadores tenham sido imageados usando um microscópio de fluorescência padrão. As imagens são então coletadas e compiladas em todos os ciclos de imagem para alcançar resolução de célula única para todos os marcadores. A coloração em etapa única e a remoção suave do fluoróforo não apenas permitem a análise de biomarcadores altamente multiplexados, mas também preservam a amostra para análise adicional a jusante, se desejado (por exemplo, coloração de hematoxilina e eosina). Além disso, o software de análise de imagens permite o processamento de imagens – compensação de deriva, subtração de fundo, segmentação celular e agrupamento – bem como a visualização e análise das imagens e fenótipos celulares para a geração de mapas de redes espaciais. Em resumo, essa tecnologia emprega um sistema microfluídico computadorizado e um microscópio de fluorescência para hibridizar, obter imagens e retirar sondas de DNA marcadas fluorescentemente que são complementares aos anticorpos conjugados a oligonucleotídeos ligados ao tecido.
O microambiente tumoral (TME) é extremamente heterogêneo, constituído por células tumorais, células estromais tumorais, células imunes, componentes não celulares da matriz extracelular e numerosas moléculas abundantes produzidas e liberadas por células tumorais, estromais eimunes1,2. Evidências acumuladas demonstram que a ETM tem um papel fundamental na reprogramação da diferenciação, crescimento, invasão, metástase e resposta a terapiastumorais3.
Compreender como os diferentes tipos celulares da EMT interagem e se comunicam entre si por meio de redes de sinalização é essencial para melhorar o diagnóstico do câncer, otimizar a imunoterapia e desenvolver novos tratamentos4. Técnicas tradicionais de microscopia tecidual, incluindo imunohistoquímica (IHQ) e imunofluorescência (IF), têm sido usadas há décadas para estudar os tipos celulares, abundância e comunicações em amostras tumorais. Infelizmente, essas técnicas tipicamente podem avaliar apenas um ou dois marcadores proteicos em um corte tecidual e não podem revelar as complexas relações espaciais e estruturais entre essas células 5,8,7.
Nas últimas duas décadas, várias tecnologias de imagem multiplexada foram estabelecidas8. Essas tecnologias fornecem visões muito melhores da composição, função e localização das células imunes dentro da TME, levando a rápidos avanços na capacidade de identificar e perfilar espacialmente TMEs complexas no nível de célula única 9,10. As relações espaciais e estruturais de várias células tumorais e imunes na EMT estão atualmente na vanguarda dos estudos biológicos e clínicos que utilizam essas tecnologias de imagem multiplexada11,12.
A tecnologia de imagem multiplexada recentemente desenvolvida usando código de barras de anticorpos conjugados com oligonucleotídeos é uma plataforma de pesquisa biológica unicelular influente baseada na detecção de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos em amostras fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE)13,14. Atualmente, essa tecnologia de imagem multiplexada permite a obtenção simultânea de imagens de mais de 100 marcadores em um único corte de tecido15, o que aumentou o número de tipos celulares que são distinguíveis in situ. Isso permite um nível de análise espacial de células tumorais e imunes que não é possível usando as abordagens tradicionais deimunofenotipagem16.
Neste artigo, descrevemos um protocolo otimizado para conjugar anticorpos purificados contra oligonucleotídeos e validar essa conjugação usando a plataforma de imagem multiplexada e um procedimento de imagem multiciclo com tecido FFPE. Além disso, descrevemos os procedimentos básicos de processamento e análise de dados utilizados com essa tecnologia.
A EMT desempenha um papel essencial no desenvolvimento, progressão e resposta ao tratamento do câncer. Além disso, a densidade de subtipos específicos de linfócitos infiltrantes de tumor na ETM pode servir como um biomarcador prognóstico para certos tipos de câncer. Notavelmente, além da composição celular da ETM, as características espaciais de um tumor podem fornecer um esboço para o entendimento da biologia do tumor e identificação de potenciais biomarcadoresprognósticos12,17.
Como numerosas populações de células imunes estão envolvidas em respostas pró-câncer ou anticâncer, uma melhor compreensão dessas células e suas relações espaciais entre si e com as células cancerosas ajudará a orientar a identificação de novas estratégias imunoterápicas. Estudos prévios estratificaram a localização e a distribuição espacial das células TME com base na estrutura tecidual nas áreas intratumorais e peritumorais e nas margens invasivas das célulastumorais18,19. Nos últimos 15 anos, os avanços tecnológicos tornaram a análise fenotípica de células individuais com base em sua dispersão espacial uma ferramenta nova e influente para estudar a ETM e categorizar potenciais biomarcadores para imunoterapia tumoral. A histoquímica do FI multiplex pode estimar simultaneamente múltiplos marcadores biológicos20.
Semelhante à estratégia de anticorpos conjugados com oligonucleotídeo, quatro tipos de plataformas multiplex baseadas em proteínas são usados para estudar a TME: sistemas de detecção de anticorpos marcados com cromogênio, fluorescência, DNA barcode e isótopos metálicos. As plataformas de IHQ cromogênicas de baixo custo permitem a visualização de lâminas inteiras e a avaliação patológica usando microscopia convencional de campo claro. No FI multiplexado e na IHQ, anticorpos conjugados com fluoróforos são usados. A plataforma multiplex IF/IHQ detecta anticorpos com alta especificidade e pode quantificar os anticorpos direcionados mesmo em nível subcelular 6,21. Além disso, devido à natureza dos cromógenos e fluoróforos, o uso de um painel de anticorpos pode capturar a expressão de até 10 biomarcadores em uma única lâmina. Em plataformas baseadas em isótopos metálicos, anticorpos marcados com metal são usados para realizar imagens multiplexadas com resolução espacial e de célula única, e alta sensibilidade para cortes individuais de tecido22. Teoricamente, essas abordagens de anticorpos conjugados a metais permitem a detecção simultânea de mais de 100 biomarcadores em uma única seção de tecido. Um desafio da técnica de marcação isotópica é a interferência isobárica, que impede que se atinja 100% de pureza do enriquecimento23. Além disso, a interferência aumenta à medida que o número de marcadores aumenta. As plataformas de detecção de anticorpos conjugados com DNA reconhecem anticorpos marcados com códigos de barras de DNA exclusivos. Mais de 40 biomarcadores podem ser capturados simultaneamente com alta especificidade nessasplataformas6.
A imagem multiplexada é uma plataforma de detecção de anticorpos marcados com código de barras de DNA comercialmente disponível para a aplicação de anticorpos conjugados ao DNA em uma única lâmina de tecido em uma única etapa (Figura 8). Para a etapa de preparação do tecido, ao contrário da plataforma de imagem por feixe de íons multiplexado, que requer o uso de lâminas revestidas com ouro obtidas dos fabricantes, a plataforma de imagem multiplexada requer apenas lamínulas regulares ou lâminas revestidas com poli-L-lisina a 0,1% para ajudar o tecido a aderir a ele e manter o tecido intacto durante o processo de coloração e imagem. Recomenda-se o uso de cortes de tecido em lamínulas dentro de 4 semanas após a secção, pois o armazenamento prolongado de lâminas não coradas resulta em redução da antigenicidade. Uma amostra de lamínula corada pode ser mantida em tampão de armazenamento a 4 °C por até 2 semanas sem perder seu sinal de coloração. Não é necessário nenhum equipamento especial para o armazenamento das amostras de lamínula. O sistema de imagem multiplexado foi atualizado para usar lâminas regulares em vez de lamínulas, o que permite a coloração de tecidos maiores e fácil manuseio. Ao utilizar uma solução de redução para conjugação de anticorpos (passo 3.2.3), a reação deve ser limitada a um máximo de 30 minutos para evitar danos aos anticorpos. Os buffers de bloqueio da etapa 5.6.6 devem ser preparados recentemente e os buffers de bloqueio não devem ser reutilizados.
Em comparação com plataformas de detecção de anticorpos multiplex marcadas com cromógenos, fluorescência e isótopos metálicos, a tecnologia de imagem multiplexada tem certas vantagens. Por exemplo, mais de 60 painéis de anticorpos pré-projetados para imagens multiplexadas estão comercialmente disponíveis, o que ajuda a economizar tempo e custos na conjugação e validação de anticorpos, e o número de painéis de anticorpos pré-projetados está crescendo. Esses anticorpos, que incluem o marcador de carcinoma pancitoqueratina, o marcador de melanoma SOX10, o marcador vascular CD31, o marcador estromal SMA e vários marcadores de células imunes, são validados e prontos para experimentação. Para anticorpos que não são pré-projetados, o kit de conjugação disponível comercialmente projetado para uso com imagens multiplexadas é simples e fácil de usar. Os anticorpos conjugados pelo cliente são bons por 1 ano quando armazenados a 4 °C. Além disso, o aquecimento da máquina não é necessário para capturar as imagens. Nessa tecnologia de imagem multiplexada, as etapas iterativas de lavagem, hibridização e remoção na aquisição das imagens raramente resultam em diminuição da intensidade dos marcadores ou morfologia tecidual degradada 5,24,25. Além disso, as imagens compostas são capturadas no formato QPTIFF com um microscópio de fluorescência tricolor simples e podem ser carregadas e analisadas usando software de análise digital de terceiros. Os marcadores de coloração podem ser visualizados em resolução unicelular, e os fenótipos celulares podem ser caracterizados através da co-localização dos marcadores (Figura 6 e Figura 7). A análise abrangente de uma imagem multiplexada revela ainda os compartimentos teciduais, a quantificação do marcador unicelular e os dados de vizinhança e proximidade mais próximos (Figura 8).
Um desafio na análise de imagens multiplexadas é a identificação do tipo celular. Normalmente, quando mais classificadores de objeto único são aplicados a uma imagem, fenótipos mais incomuns serão anotados. Portanto, recomenda-se o uso de marcadores conhecidos que não são co-expressos no mesmo classificador e a aplicação apenas do classificador relacionado ao fenótipo à anotação de células únicas. Variações na anotação do tipo celular resultarão em resultados espaciais substancialmente diferentes, tais como diferenças na distribuição espacial celular e análise de vizinhança celular26,27.
A análise de imagens multiplexadas provou ser bem-sucedida na coloração e geração de imagens de muitos tipos de amostras, incluindo tecido FFPE, tecido fresco congelado, lâminas inteiras arquivadas e microarrays de tecido. Imagens multiplexadas de cortes de mama, cérebro, pulmão, baço, rim, linfonodo e tecido cutâneo podem ser adquiridas com dados profundos de fenotipagem espacial unicelular 5,16,25,28.
No futuro, mais anticorpos pré-projetados para imagens multiplexadas são esperados. Além disso, o desenvolvimento de softwares específicos para análise de imagens multiplexadas é extremamente necessário. Atualmente, existem muitos softwares disponíveis comercialmente e de código aberto para análise de imagens Hi-Plex29, mas os cientistas ainda precisam de ajuda na criação de um fluxo de trabalho padrão para essas análises30,31. Embora as imagens compostas capturadas usando este protocolo sejam compatíveis com software de terceiros, isso pode resultar em custos extras para o usuário. Outra desvantagem da tecnologia de imagem multiplexada é a redução do sinal na detecção de proteínas nucleares após lavagem iterativa, hibridização e remoção com grandes painéis de anticorpos. Felizmente, isso pode ser minimizado recuperando os fluoróforos com código de barras nos ciclos iniciais ao projetar as placas do repórter. Recentemente, essa plataforma foi atualizada com um novo sistema de varredura de alta velocidade, que reduziu drasticamente o tempo de obtenção de imagens compostas32. Além disso, uma nova estratégia usando códigos de barras conjugados com tiramida foi relatada para melhorar a imagem baseada em código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeo. Essa tecnologia visa amplificar sinais de coloração para os quais anticorpos conjugados com código de barras são difíceis de obter33.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Donald R. Norwood da Editing Services, Research Medical Library at MD Anderson pela edição deste artigo e ao IF multiplex e laboratório de análise de imagens do Departamento de Patologia Molecular Translacional do MD Anderson. Este projeto foi apoiado em parte pelo laboratório Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling (TMP-IL) Moonshots Platform no Departamento de Patologia Molecular Translacional, The University of Texas MD Anderson Cancer Center e NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (para o MD Anderson Cancer Center CIMAC).
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |