多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。
同一組織切片内の複数のエピトープを順次検出するオリゴヌクレオチドを用いた抗体バーコーディングを用いたマルチプレックスイメージング技術は、腫瘍微小環境の理解を向上させる腫瘍評価に有効な方法論です。ホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるタンパク質発現の可視化は、特定の蛍光色素を相補的なオリゴヌクレオチド を介して 抗体結合バーコードにアニーリングし、サンプルイメージングを行うことで実現されます。実際、この方法では、1回の組織染色反応で40を超える抗体のカスタマイズ可能なパネルを使用できます。この方法は、新鮮な凍結組織、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織、培養細胞、および末梢血単核細胞と互換性があるため、研究者はこの技術を使用して、さまざまなサンプルタイプを単一細胞の解像度で表示できます。この方法は、手動の染色および固定プロトコルから始まり、すべての抗体バーコードは抗体カクテルを使用して適用されます。染色流路計測器は完全に自動化されており、標準的な蛍光顕微鏡を使用してすべてのバイオマーカーがイメージングされるまで、スペクトル的に異なる蛍光色素の標識、イメージング、除去の反復サイクルを実行します。次に、画像を収集し、すべてのイメージングサイクルにわたってコンパイルして、すべてのマーカーの単一セル解像度を実現します。シングルステップ染色と穏やかな蛍光色素除去により、高度にマルチプレックス化されたバイオマーカー分析が可能になるだけでなく、必要に応じて追加の下流分析(ヘマトキシリンやエオジン染色など)のためにサンプルを保存することもできます。さらに、画像解析ソフトウェアは、画像処理(ドリフト補正、バックグラウンド減算、細胞セグメンテーション、クラスタリング)を可能にし、空間ネットワークマップを生成するための画像と細胞表現型の視覚化と分析を可能にします。要約すると、この技術は、コンピューター化されたマイクロ流体システムと蛍光顕微鏡を使用して、組織結合したオリゴヌクレオチド結合抗体に相補的な蛍光標識DNAプローブを反復的にハイブリダイズ、画像化、およびストリップします。
腫瘍微小環境(TME)は極めて不均一であり、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、免疫細胞、細胞外マトリックスの非細胞成分、および腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞によって産生および放出される多数の豊富な分子で構成されています1,2。証拠の蓄積は、TMEが腫瘍の分化、成長、浸潤、転移、および治療への反応を再プログラミングする上で極めて重要な役割を果たすことを示しています3。
TMEの異なる細胞タイプがシグナル伝達ネットワークを介してどのように相互作用し、互いに通信するかを理解することは、がん診断の改善、免疫療法の最適化、および新しい治療法の開発に不可欠です4。免疫組織化学(IHC)や免疫蛍光(IF)などの従来の組織顕微鏡技術は、腫瘍サンプル中の細胞の種類、存在量、およびコミュニケーションを研究するために何十年も使用されてきました。残念なことに、これらの技術は通常、組織切片における1つまたは2つのタンパク質マーカーのみを評価することができ、これらの細胞間の複雑な空間的および構造的関係を明らかにすることはできない5、8、7。
過去20年間で、いくつかの多重化イメージング技術が確立されてきました8。これらの技術は、TME内の免疫細胞の組成、機能、および位置のビューを大幅に改善し、単一細胞レベルで複雑なTMEを識別し、空間的にプロファイリングする能力の急速な進歩につながります9,10。TMEにおけるさまざまな腫瘍細胞と免疫細胞の空間的および構造的関係は、現在、これらの多重イメージング技術を使用した生物学的および臨床的研究の最前線にあります11,12。
最近開発されたオリゴヌクレオチド結合抗体バーコーディングを用いたマルチプレックスイメージング技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプル中のオリゴヌクレオチド結合抗体の検出に基づく影響力のある単一細胞生物学的研究プラットフォームです13,14。現在、この多重化された画像化技術は、単一の組織切片15における100を超えるマーカーの同時画像化を可能にし、これにより、その場で区別可能な細胞型の数が増加している。これにより、従来のイムノフェノタイピングアプローチでは不可能なレベルの腫瘍および免疫細胞の空間分析が可能になります16。
ここでは、精製された抗体をオリゴヌクレオチドに結合させ、マルチプレックスイメージングプラットフォームとFFPE組織を用いたマルチサイクルイメージング手順を使用してこの結合を検証するための最適化されたプロトコルについて説明します。さらに、この技術で使用される基本的な画像処理とデータ解析の手順について説明します。
TMEは、がんの発生、進行、および治療反応に不可欠な役割を果たします。さらに、TMEにおける特定の腫瘍浸潤リンパ球サブセットの密度は、特定の種類の癌の予後バイオマーカーとして役立つ可能性があります。驚くべきことに、TMEの細胞組成に加えて、腫瘍の空間的特徴は、腫瘍の生物学を理解し、潜在的な予後バイオマーカーを特定するためのアウトラインを提供することができます12,17。
多くの免疫細胞集団が前がんまたは抗がん反応に関与しているため、これらの細胞と、それらの相互およびがん細胞との空間的関係をよりよく理解することは、新しい免疫療法戦略の特定に役立ちます。以前の研究では、腫瘍内および腫瘍周囲領域の組織構造と腫瘍細胞の浸潤性辺縁に基づいて、TME細胞の位置と空間分布を層別化しています18,19。過去15年間、技術の進歩により、空間分散に基づく個々の細胞の表現型解析は、TMEを研究し、腫瘍免疫療法の潜在的なバイオマーカーを分類するための新しい影響力のあるツールになりました。多重IF組織化学は、複数の生物学的マーカー20を同時に推定することができる。
オリゴヌクレオチド結合抗体戦略と同様に、TMEの研究には、色原体、蛍光、DNAバーコード、および金属同位体標識抗体検出システムの4種類のタンパク質ベースのマルチプレックスプラットフォームが使用されます。費用対効果の高い発色IHCプラットフォームは、従来の明視野顕微鏡を使用して、スライド全体の視覚化と病理学的評価を可能にします。マルチプレックスIFおよびIHCでは、蛍光色素と結合させた抗体が使用されます。マルチプレックスIF/IHCプラットフォームは、高い特異性で抗体を検出し、細胞内レベルでも標的抗体を定量することができます6,21。さらに、発色体と蛍光色素の性質上、1枚の抗体パネルを使用することで、1枚のスライドで最大10個のバイオマーカーの発現を捉えることができます。金属同位体ベースのプラットフォーム上では、金属タグ付き抗体を使用して、単一細胞および空間分解能で多重化イメージングを実行し、個々の組織切片22に対して高感度を実行する。理論的には、これらの金属結合抗体アプローチにより、単一の組織切片で100を超えるバイオマーカーを同時に検出できます。同位体標識技術の課題の1つは、100%の純度の濃縮が23に達するのを妨げる同重体干渉です。さらに、マーカーの数が増えると干渉が増加します。DNA結合抗体検出プラットフォームは、固有のDNAバーコードで標識された抗体を認識します。これらのプラットフォームでは、40を超えるバイオマーカーを高い特異性で同時に捕捉できます6。
マルチプレックスイメージングは、DNA結合抗体を1つの組織スライドにワンステップで適用するための市販のDNAバーコード標識抗体検出プラットフォームです(図8)。組織調製段階では、メーカーから入手した金コーティングされたスライドを使用する必要があるマルチプレックスイオンビームイメージングプラットフォームとは異なり、マルチプレックスイメージングプラットフォームでは、通常のカバーガラスまたは0.1%ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドのみを使用して、組織が接着し、染色およびイメージングプロセス中に組織を無傷に保つのに役立ちます。染色されていないスライドを長期間保存すると抗原性が低下するため、切片作成後4週間以内にカバーガラスに組織切片を使用することをお勧めします。染色されたカバーガラスサンプルは、染色シグナルを失うことなく、4°Cの保存バッファーで最大2週間維持できます。カバーガラスサンプルの保管に特別な装置は必要ありません。マルチプレックスイメージングシステムは、カバーガラスの代わりに通常のスライドを使用するようにアップグレードされ、より大きな組織の染色と簡単な取り扱いが可能になりました。抗体結合に還元溶液を使用する場合(ステップ3.2.3)、抗体の損傷を防ぐために、反応を30分以内に制限する必要があります。手順 5.6.6 のブロッキングバッファは新しく準備する必要があり、ブロッキングバッファは再利用しないでください。
色原体、蛍光、および金属同位体標識マルチプレックス抗体検出プラットフォームと比較して、マルチプレックスイメージング技術には特定の利点があります。例えば、マルチプレックスイメージング用に60を超える設計済み抗体パネルが市販されており、抗体結合および検証の時間とコストを節約するのに役立ち、事前に設計された抗体パネルの数は増加しています。これらの抗体には、がんマーカーの汎サイトケラチン、黒色腫マーカーSOX10、血管マーカーCD31、間質マーカーSMA、および多数の免疫細胞マーカーが含まれ、検証済みで実験の準備ができています。事前に設計されていない抗体の場合、マルチプレックスイメージングで使用するために設計された市販のコンジュゲーションキットは簡単でユーザーフレンドリーです。顧客結合抗体は、4°Cで保存した場合、1年間有効です。 さらに、画像をキャプチャするために機械のウォームアップは必要ありません。このマルチプレックスイメージング技術では、画像取得における反復洗浄、ハイブリダイゼーション、およびストリッピングステップが、マーカー強度の低下または組織形態の劣化をもたらすことはめったにありません5、24、25。さらに、合成画像は、シンプルな3色蛍光顕微鏡でQPTIFF形式でキャプチャされ、サードパーティのデジタル分析ソフトウェアを使用してアップロードおよび分析できます。染色マーカーは単一細胞の解像度で視覚化でき、細胞の表現型はマーカーの共局在によって特徴付けることができます(図6および図7)。多重化された画像を包括的に解析することで、組織コンパートメント、単一細胞マーカーの定量化、最近傍および近接データをさらに明らかにします(図8)。
多重画像解析における課題は、細胞型の同定です。通常、より多くの単一オブジェクト分類器が画像に適用されると、より一般的でない表現型に注釈が付けられます。したがって、同じ分類器で共発現していない既知のマーカーを使用し、表現型関連の分類器のみを単一細胞のアノテーションに適用することが推奨されます。細胞タイプのアノテーションのばらつきは、細胞の空間分布や細胞近傍解析の違いなど、実質的に異なる空間結果をもたらします26,27。
マルチプレックス画像解析は、FFPE組織、新鮮な凍結組織、アーカイブされたスライド全体、組織マイクロアレイなど、多くのサンプルタイプの染色とイメージングに成功することが証明されています。乳房、脳、肺、脾臓、腎臓、リンパ節、および皮膚組織切片の多重化された画像は、深い単一細胞空間表現型データ5、16、25、28を用いて取得することができる。
将来的には、マルチプレックスイメージング用に事前に設計された抗体が増えることが期待されています。さらに、多重化された画像解析のための特定のソフトウェアの開発が大いに必要とされています。現在、Hi-Plex画像解析用の市販のオープンソースソフトウェアプログラムは数多く存在しますが29、科学者はこれらの分析の標準ワークフローを作成する際に依然として支援を必要としています30,31。このプロトコルを使用してキャプチャされた合成画像はサードパーティのソフトウェアと互換性がありますが、これによりユーザーに余分なコストがかかる可能性があります。マルチプレックスイメージング技術の別の欠点は、反復洗浄、ハイブリダイゼーション、および抗体の大きなパネルによるストリッピング後の核タンパク質検出におけるシグナルの減少です。幸いなことに、レポータープレートを設計する際の早いサイクルでバーコード化された蛍光色素を取得することで、これを最小限に抑えることができます。最近、このプラットフォームは、新しい高速スキャンシステムでアップグレードされ、合成画像32を取得する時間を劇的に短縮した。さらに、チラミド結合バーコードを用いた新しい戦略が、オリゴヌクレオチド結合抗体のバーコードベースのイメージングを強化することが報告されています。この技術は、バーコード結合抗体では入手が困難な染色シグナルを増幅することを目的としています33。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、この記事を編集してくれたMDアンダーソンの研究医学図書館の編集サービスのドナルドR.ノーウッドと、MDアンダーソンのトランスレーショナル分子病理学部門のマルチプレックスIFおよび画像分析研究所に感謝します。このプロジェクトの一部は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター、トランスレーショナル分子病理学科のトランスレーショナル分子病理学-免疫プロファイリング研究所(TMP-IL)ムーンショットプラットフォーム、およびNCI協力協定U24CA224285(MDアンダーソンがんセンターCIMACへ)によってサポートされました。
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |