Неинвазивная ультразвуковая оценка прогрессирования рака эндометрия при Pax8-направленной делеции опухолевых супрессоров Arid1a и Pten у мышей
Summary
В этом протоколе описывается метод мониторинга прогрессирования морфологических изменений с течением времени в матке в индуцируемой мышиной модели рака эндометрия с использованием ультразвуковой визуализации с корреляцией с грубыми и гистологическими изменениями.
Abstract
Рак матки может быть изучен на мышах из-за простоты обращения и генетических манипуляций в этих моделях. Тем не менее, эти исследования часто ограничиваются оценкой патологии посмертно у животных, усыпленных в несколько моментов времени в разных когортах, что увеличивает количество мышей, необходимых для исследования. Визуализация мышей в лонгитюдных исследованиях может отслеживать прогрессирование заболевания у отдельных животных, уменьшая количество необходимых мышей. Достижения в области ультразвуковой технологии позволили обнаружить изменения в тканях на микрометровом уровне. Ультразвук использовался для изучения созревания фолликулов в яичниках и роста ксенотрансплантата, но не применялся к морфологическим изменениям в матке мыши. В этом протоколе исследуется сопоставление патологии со сравнением изображений in vivo в мышиной модели с индуцированным раком эндометрия. Признаки, наблюдаемые при УЗИ, соответствовали степени изменения, наблюдаемым при грубой патологии и гистологии. Было обнаружено, что ультразвук обладает высокой степенью прогнозирования наблюдаемой патологии, поддерживая включение ультразвукового исследования в лонгитюдные исследования заболеваний матки, таких как рак у мышей.
Introduction
Мыши остаются одной из наиболее важных животных моделей репродуктивных расстройств 1,2,3. Существует несколько генетически модифицированных или индуцированных моделей рака яичников и матки у грызунов. Эти исследования обычно опираются на несколько когорт, подвергшихся эвтаназии в разные моменты времени, чтобы зафиксировать продольные тенденции морфологических и патологических изменений. Это препятствует получению непрерывных данных о развитии рака у отдельной мыши. Кроме того, не зная отдельного состояния прогрессирования заболевания мыши, интервенционные исследования основаны на заранее определенных временных точках и усредненных результатах предыдущих когорт, а не на отдельных пороговых значениях для обнаружения прогрессирования у конкретного животного 4,5. Таким образом, подходы к визуализации, которые позволяют проводить продольную оценку на живых животных, необходимы для облегчения доклинических моделей для тестирования новых лекарств или соединений и ускорения понимания патобиологии, а также повышения строгости и воспроизводимости6.
Ультразвуковая визуализация (УЗИ) является привлекательным методом для продольного мониторинга прогрессирования рака матки мышей, поскольку она относительно проста и недорога по сравнению с другими методами визуализации, проста в выполнении и может иметь замечательное разрешение 6,7. Этот неинвазивный метод может фиксировать особенности в микронном масштабе у бодрствующих мышей или у мышей, находящихся под кратковременной седацией, с использованием 5-10-минутного исследования. Ультразвуковая микроскопия была валидирована как метод измерения развития фолликулов яичников мыши 8 и роста имплантированной или индуцированной неоплазии 9,10,11. Высокочастотное УЗИ также использовалось для чрескожных внутриматочных инъекций12 и наблюдения за изменениями матки у крыс в течение циклатечки 13. Высокочастотный УЗИ можно использовать с мышами, удерживаемыми на специализированных стационарных платформах с использованием рельсовой системы для удержания преобразователя/зонда для захвата изображений с высоким разрешением со стандартизированным положением и давлением; Однако это оборудование доступно не во всех учреждениях. Методы сканирования с помощью ручного датчика могут быть приняты с менее специализированным оборудованием и использоваться как для клинической диагностики, так и для исследований на мышах.
Остается открытым вопрос о том, можно ли использовать визуализацию УЗИ с помощью портативных высокочастотных зондов для мониторинга развития рака матки в течение нескольких недель. Подобно кишечнику, матка грызунов представляет собой тонкостенную тонкую структуру, которая очень подвижна в брюшной полости и непрерывна через несколько глубин тканей, что делает визуализацию более сложной, чем с относительно неподвижными органами, такими как почки. Это исследование было направлено на установление корреляции между тканями, наблюдаемыми с помощью ультразвука, и гистопатологией, определение ориентиров для определения местоположения матки мыши и определение возможности продольной оценки рака эндометрия. В этом исследовании представлены данные, показывающие качественное соответствие между внешним видом матки, сфотографированной с помощью УЗИ, и гистопатологией, а также серийной визуализацией мышей в течение нескольких недель. Эти результаты показывают, что портативный УЗИ можно использовать для мониторинга развития рака эндометрия у мышей, тем самым создавая возможность для сбора индивидуальных продольных данных мыши для изучения рака матки без необходимости использования специального оборудования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе исследуется полезность ультразвука для оценки морфологических изменений матки при прогрессировании аденокарциномы в матке у мышей. В этом исследовании, проследив за индукцией рака эндометрия у мышей в продольном направлении, анатомические детали, обнаруженные с пом?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за финансирование со стороны программы SPORE рака яичников NCI P50CA228991, программы постдокторской подготовки 5T32OD011089 и Фонда Ричарда В. Телинде Университета Джона Хопкинса. Проект также частично финансировался за счет субсидий на текущие расходы частным высшим учебным заведениям от Корпорации содействия и взаимопомощи частным школам Японии.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
