マウスにおける腫瘍抑制因子 Arid1a および Pten のPax8指向性欠失における子宮内膜癌進行の非侵襲的超音波評価
Summary
このプロトコルは、肉眼的および組織学的変化との相関を有する超音波画像を用いて、子宮内膜癌の誘導性マウスモデルにおける子宮内の形態学的変化の経時的な進行をモニターするための方法を記載する。
Abstract
子宮がんは、これらのモデルでの取り扱いと遺伝子操作の容易さのためにマウスで研究することができます。ただし、これらの研究は、異なるコホートの複数の時点で安楽死させた動物の死後の病理の評価に限定されることが多く、研究に必要なマウスの数が増加します。縦断的研究でマウスをイメージングすると、個々の動物の病気の進行を追跡できるため、必要なマウスの数を減らすことができます。超音波技術の進歩により、組織のマイクロメートルレベルの変化を検出できるようになりました。超音波は、卵巣の卵胞成熟および異種移植片の成長を研究するために使用されてきましたが、マウスの子宮の形態学的変化には適用されていません。このプロトコルは、誘発された子宮内膜がんマウスモデルにおける in vivo イメージング比較と病理学の並置を調べます。超音波によって観察された特徴は、肉眼的病理学および組織学によって見られる変化の程度と一致していた。超音波は観察された病状を高度に予測することがわかり、マウスの癌などの子宮疾患の縦断的研究への超音波検査の組み込みを支持しました。
Introduction
マウスは、生殖障害の最も重要な動物モデルの1つであり続けています1,2,3。卵巣がんおよび子宮がんの遺伝子組み換えまたは誘発されたげっ歯類モデルがいくつかあります。これらの研究は通常、形態学的および病理学的変化の縦断的傾向を把握するために、異なる時点で安楽死させた複数のコホートに依存しています。これにより、個々のマウスにおける癌発生に関する継続的なデータを取得する能力が妨げられる。さらに、個々のマウス疾患進行状態を知らなくても、介入研究は、特定の動物における進行を検出するための個々の閾値ではなく、所定の時点および以前のコホートの平均所見に基づいている4,5。したがって、新薬や化合物を試験するための前臨床モデルを促進し、病理生物学の理解を加速すると同時に、厳密さと再現性を高めるために、生きた動物での縦断的評価を可能にするイメージングアプローチが必要です6。
超音波イメージング(米国)は、他のイメージング方法と比較して比較的簡単で安価であり、実行が容易であり、驚くべき解像度を持つことができるため、マウス子宮がんの進行の縦断的モニタリングにとって魅力的な方法です6,7。この非侵襲的モダリティは、覚醒マウスまたは5〜10分の検査を使用して短時間の鎮静下にあるマウスでミクロンスケールの特徴をキャプチャできます。超音波顕微鏡は、マウス卵巣卵胞の発達8および移植または誘発された腫瘍の成長を測定する方法として検証されています9、10、11。高周波USはまた、経皮的子宮内注射12および発情周期13にわたるラット子宮変化の観察にも使用されている。高周波USは、レールシステムを使用してトランスデューサ/プローブを保持し、標準化された位置と圧力で高解像度の画像をキャプチャする特殊な固定プラットフォームにマウスを保持します。ただし、この機器はすべての機関で利用できるわけではありません。ハンドヘルドトランスデューサースキャン法は、より少ない専用機器で採用でき、マウスの臨床診断と研究アプリケーションの両方に使用できます。
ハンドヘルド高周波プローブを使用した米国のイメージングを使用して、数週間にわたって子宮がんの発生を監視できるかどうかという疑問が残ります。腸と同様に、げっ歯類の子宮は薄壁の細い構造であり、腹部内で非常に可動性があり、複数の組織の深さに隣接しているため、腎臓などの比較的動かない臓器よりもイメージングが困難です。この研究は、超音波によって観察された組織と組織病理学の間の相関を確立し、マウスの子宮を見つけるためのランドマークを定義し、 子宮内膜がんの縦断的評価の実現可能性。この研究は、米国によって画像化された子宮の出現と組織病理学との間の定性的対応を示すデータを提示し、数週間にわたるマウスの連続画像も提示します。これらの結果は、ハンドヘルドUSを使用してマウスの子宮内膜がんの発生をモニタリングできるため、専用の機器を必要とせずに個々のマウス縦断データを収集して子宮がんを研究する機会が生まれることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウスの子宮内の腺癌の進行における子宮形態学的変化を評価するための超音波の有用性を調べます。本研究では、マウスの子宮内膜がんの誘導を縦断的に追跡することにより、超音波によって検出された解剖学的詳細が肉眼的および組織学的病理の指標となることが判明した。これにより、マウスの子宮がんの進行を追跡するために、複数の時点で超音波によって監視?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCI卵巣がん胞子プログラムP50CA228991、ポスドク研修プログラム5T32OD011089、ジョンズ・ホプキンス大学のリチャード・W・テリンデ基金からの資金提供に感謝している。また、私立学校振興・共済機構の私立高等教育機関への経常支出補助金も一部賄いました。
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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