Nicht-invasive Ultraschalluntersuchung der Progression des Endometriumkarzinoms bei Pax8-gerichteter Deletion der Tumorsuppressoren Arid1a und Pten in Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung des Fortschreitens morphologischer Veränderungen im Laufe der Zeit im Uterus in einem induzierbaren Mausmodell des Endometriumkarzinoms mittels Ultraschallbildgebung mit Korrelation zu groben und histologischen Veränderungen.
Abstract
Gebärmutterkrebs kann aufgrund der einfachen Handhabung und genetischen Manipulation in diesen Modellen an Mäusen untersucht werden. Diese Studien beschränken sich jedoch oft auf die postmortale Beurteilung der Pathologie bei Tieren, die zu mehreren Zeitpunkten in verschiedenen Kohorten eingeschläfert wurden, was die Anzahl der für eine Studie benötigten Mäuse erhöht. Die Bildgebung von Mäusen in Längsschnittstudien kann das Fortschreiten der Krankheit bei einzelnen Tieren verfolgen und so die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren. Fortschritte in der Ultraschalltechnologie haben es ermöglicht, Veränderungen im Mikrometerbereich in Geweben zu erkennen. Ultraschall wurde verwendet, um die Follikelreifung in den Eierstöcken und das Wachstum von Xenotransplantaten zu untersuchen, aber nicht auf morphologische Veränderungen in der Gebärmutter der Maus. Dieses Protokoll untersucht die Gegenüberstellung von Pathologie und In-vivo-Bildgebungsvergleichen in einem Mausmodell für induziertes Endometriumkarzinom. Die im Ultraschall beobachteten Merkmale stimmten mit dem Grad der Veränderung überein, der in der groben Pathologie und Histologie beobachtet wurde. Es wurde festgestellt, dass Ultraschall die beobachtete Pathologie in hohem Maße prädiktiv darstellt und die Einbeziehung der Ultraschalluntersuchung in Längsschnittstudien von Gebärmuttererkrankungen wie Krebs bei Mäusen unterstützt.
Introduction
Mäuse sind nach wie vor eines der wichtigsten Tiermodelle für Fortpflanzungsstörungen 1,2,3. Es gibt mehrere genetisch veränderte oder induzierte Nagetiermodelle für Eierstock- und Gebärmutterkrebs. Diese Studien stützen sich in der Regel auf mehrere Kohorten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten euthanasiert wurden, um longitudinale Trends in morphologischen und pathologischen Veränderungen zu erfassen. Dadurch wird verhindert, dass kontinuierlich Daten über die Krebsentwicklung einer einzelnen Maus gewonnen werden können. Darüber hinaus basieren Interventionsstudien ohne Kenntnis des individuellen Krankheitsverlaufs der Maus auf vorgegebenen Zeitpunkten und gemittelten Ergebnissen früherer Kohorten und nicht auf individuellen Schwellenwerten für den Nachweis der Progression bei einem bestimmten Tier 4,5. Daher sind bildgebende Ansätze erforderlich, die eine longitudinale Beurteilung in lebenden Tieren ermöglichen, um präklinische Modelle für die Erprobung neuer Medikamente oder Wirkstoffe zu erleichtern und das Verständnis der Pathobiologie zu beschleunigen und gleichzeitig die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen6.
Die Ultraschallbildgebung (US) ist eine attraktive Methode für die longitudinale Überwachung der Progression von Gebärmutterkrebs bei Mäusen, da sie im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren relativ einfach und kostengünstig ist, einfach durchzuführen ist und eine bemerkenswerte Auflösung aufweisen kann 6,7. Diese nicht-invasive Modalität kann Merkmale im Mikrometerbereich bei wachen Mäusen oder bei Mäusen unter kurzer Sedierung mit einer 5-10-minütigen Untersuchung erfassen. Die Ultraschallmikroskopie wurde als Methode zur Messung der Entwicklung der Ovarialfollikel der Maus 8 und des Wachstums von implantierten oder induzierten Neoplasienvalidiert 9,10,11. Hochfrequenz-US wurde auch für perkutane intrauterine Injektionen12 und die Beobachtung der Uterusveränderung von Ratten während des Brunstzyklus13 verwendet. Hochfrequenz-US kann mit Mäusen verwendet werden, die auf speziellen stationären Plattformen gehalten werden, wobei ein Schienensystem verwendet wird, um den Wandler/die Sonde zu halten, um hochauflösende Bilder mit standardisierter Position und Druck aufzunehmen. Diese Geräte sind jedoch nicht an allen Einrichtungen verfügbar. Tragbare Schallkopf-Scanmethoden können mit weniger speziellen Geräten übernommen und sowohl für die klinische Diagnostik als auch für Forschungsanwendungen an Mäusen verwendet werden.
Es bleibt die Frage, ob die US-Bildgebung mit tragbaren Hochfrequenzsonden verwendet werden könnte, um die Entwicklung von Gebärmutterkrebs über mehrere Wochen zu überwachen. Ähnlich wie der Darm ist der Uterus von Nagetieren eine dünnwandige, schlanke Struktur, die innerhalb des Bauches sehr beweglich ist und durch mehrere Gewebetiefen angrenzt, was die Bildgebung schwieriger macht als bei relativ unbeweglichen Organen wie den Nieren. Ziel dieser Studie war es, die Korrelation zwischen dem mittels Ultraschall beobachteten Gewebe und der Histopathologie herzustellen, Orientierungspunkte für die Lokalisierung des Uterus der Maus zu definieren und die Durchführbarkeit der longitudinalen Beurteilung von Endometriumkarzinomen zu bestimmen. In dieser Studie werden Daten präsentiert, die eine qualitative Übereinstimmung zwischen dem Erscheinungsbild der Uteri in den USA und der Histopathologie sowie der seriellen Bildgebung von Mäusen über mehrere Wochen zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass tragbare US zur Überwachung der Entwicklung von Endometriumkrebs bei Mäusen verwendet werden kann, wodurch die Möglichkeit geschaffen wird, individuelle Längsschnittdaten von Mäusen zu sammeln, um Gebärmutterkrebs zu untersuchen, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll untersucht den Nutzen von Ultraschall zur Beurteilung der morphologischen Veränderungen der Gebärmutter bei der Progression eines Adenokarzinoms in der Gebärmutter bei Mäusen. In dieser Studie wurden durch die Verfolgung der Induktion von Endometriumkarzinomen bei Mäusen in Längsrichtung die durch Ultraschall erfassten anatomischen Details als Indikatoren für grobe und histologische Pathologie identifiziert. Dies öffnet die Tür für den Einsatz von Längsschnittstudien mit einer kleineren Anzahl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Förderung durch das NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, das Postdoktoranden-Trainingsprogramm 5T32OD011089 und die Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Das Projekt wurde auch teilweise durch die Subventionen für laufende Ausgaben an private Hochschulen von der Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan finanziert.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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