마우스에서 종양 억제인자 Arid1a 및 Pten 의 Pax8 지시 결실에서 자궁내막암 진행의 비침습적 초음파 평가
Summary
이 프로토콜은 전체 및 조직학적 변화와 상관관계가 있는 초음파 영상을 사용하여 자궁내막암의 유도성 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 형태학적 변화의 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
자궁암은 이러한 모델에서 취급 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 생쥐에서 연구될 수 있습니다. 그러나 이러한 연구는 종종 다른 코호트에서 여러 시점에서 안락사된 동물의 사후 병리를 평가하는 것으로 제한되며, 이는 연구에 필요한 마우스의 수를 증가시킵니다. 종단 연구에서 이미징 마우스는 개별 동물의 질병 진행을 추적하여 필요한 마우스의 수를 줄일 수 있습니다. 초음파 기술의 발전으로 조직의 마이크로미터 수준의 변화를 감지할 수 있게 되었습니다. 초음파는 난소의 난포 성숙과 이종 이식 성장을 연구하는 데 사용되었지만 마우스 자궁의 형태학적 변화에는 적용되지 않았습니다. 이 프로토콜은 유도된 자궁내막암 마우스 모델에서 병리학과 생체 내 이미징 비교의 병치를 조사합니다. 초음파로 관찰된 특징은 육안적 병리학 및 조직학에서 볼 수 있는 변화의 정도와 일치했습니다. 초음파는 관찰 된 병리를 매우 예측하는 것으로 밝혀졌으며, 생쥐의 암과 같은 자궁 질환의 종단 연구에 초음파 검사의 통합을 지원합니다.
Introduction
마우스는 생식 장애에 대한 가장 중요한 동물 모델 중 하나이다 1,2,3. 난소암과 자궁암의 여러 유전자 변형 또는 유도 설치류 모델이 있습니다. 이러한 연구는 일반적으로 형태학적 및 병리학적 변화의 종단적 경향을 포착하기 위해 서로 다른 시점에서 안락사된 여러 코호트에 의존합니다. 이것은 개별 마우스에서 암 발병에 대한 지속적인 데이터를 획득하는 능력을 방지합니다. 추가적으로, 개별 마우스의 질병 진행 상태를 알지 못하면, 개입 연구는 특정 동물에서 진행을 검출하기 위한 개별 역치보다는 미리 결정된 시점과 이전 코호트의 평균 소견을 기반으로 한다 4,5. 따라서 신약 또는 화합물 테스트를 위한 전임상 모델을 용이하게 하고 병리학에 대한 이해를 가속화하는 동시에 엄격함과 재현성을 높이기 위해 살아있는 동물에서 종단적 평가를 허용하는 이미징 접근법이 필요합니다6.
초음파 영상(US)은 다른 영상 방법에 비해 상대적으로 쉽고 저렴하며 수행하기 쉽고 놀라운 해상도를 가질 수 있기 때문에 마우스 자궁암 진행의 종단 모니터링에 매력적인 방법입니다 6,7. 이 비침습적 방식은 깨어 있는 생쥐 또는 5-10분 검사를 사용하여 짧은 진정 상태에서 생쥐에서 미크론 규모의 특징을 포착할 수 있습니다. 초음파 현미경은 마우스 난포 발달 8 및 이식 또는 유도된 신생물의 성장을 측정하는 방법으로 검증되었다 9,10,11. 고주파 US는 또한 경피적 자궁내 주사12 및 발정 주기13 동안 쥐의 자궁 변화 관찰에 사용되었다. 고주파 US는 표준화된 위치와 압력으로 고해상도 이미지를 캡처하기 위해 변환기/프로브를 고정하는 레일 시스템을 사용하여 특수 고정 플랫폼에 고정된 마우스와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 이 장비는 모든 기관에서 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 휴대용 변환기 스캐닝 방법은 덜 전용 장비로 채택할 수 있으며 마우스의 임상 진단 및 연구 응용 프로그램 모두에 사용할 수 있습니다.
휴대용 고주파 프로브를 사용한 미국 이미징을 사용하여 여러 주에 걸쳐 자궁암 발병을 모니터링할 수 있는지 여부에 대한 의문이 남아 있습니다. 내장과 유사하게 설치류 자궁은 복부 내에서 매우 움직이고 여러 조직 깊이를 통해 인접해 있는 얇고 가느다란 구조로 신장과 같이 상대적으로 움직이지 않는 기관보다 이미징이 더 어렵습니다. 이 연구는 초음파로 관찰된 조직과 조직병리학 사이의 상관관계를 확립하고, 마우스 자궁을 찾기 위한 랜드마크를 정의하고, 자궁내막암의 종단적 평가의 타당성을 결정하고자 했습니다. 이 연구는 미국에 의해 이미지화된 자궁의 모양과 조직 병리학 사이의 질적 일치를 보여주는 데이터와 몇 주에 걸친 마우스의 연속 이미징을 보여줍니다. 이러한 결과는 휴대용 US가 마우스의 자궁내막암 발병을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타내며, 따라서 전용 장비 없이 자궁암을 연구하기 위해 개별 마우스 종단 데이터를 수집할 수 있는 기회를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 생쥐의 자궁 내 선암 진행에서 자궁 형태학적 변화를 평가하기 위한 초음파의 유용성을 조사합니다. 본 연구에서는 생쥐에서 자궁내막암의 유도를 종단으로 추적하여 초음파로 검출된 해부학적 세부 사항이 육안적 및 조직학적 병리의 지표임을 밝혀냈다. 이것은 생쥐에서 자궁암의 진행을 추적하기 위해 여러 시점에서 초음파로 모니터링되는 더 적은 수의 생쥐를 대상으로 종단 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCI 난소암 포자 프로그램 P50CA228991, 박사후 과정 교육 프로그램 5T32OD011089 및 존스 홉킨스 대학의 Richard W. TeLinde Endowment의 자금 지원에 감사드립니다. 이 프로젝트는 또한 일본 사립 학교 진흥 및 상호 원조 공사 (Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan)의 사립 고등 교육 기관에 대한 경상 지출에 대한 보조금으로 부분적으로 자금을 조달 받았다.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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