Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSense'in uygulanması
Summary
Canlı hücrelerde ALDH1A1 aktivitesini ölçme yöntemleri, köklülüğün biyobelirteci olarak statüsü nedeniyle kanser araştırmalarında kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 aktivitesinin göreceli seviyelerini belirlemek için izoform seçici bir florojenik prob kullandık.
Abstract
Kanser tedavisinden sonra nüks genellikle kanser kök hücreleri (CSC’ler) olarak bilinen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonunun kalıcılığına atfedilir ve bunlar dikkat çekici tümör başlatıcı ve kendini yenileme kapasiteleri ile karakterize edilir. Tümörün kökenine (örneğin, yumurtalıklar) bağlı olarak, CSC yüzey biyobelirteç profili önemli ölçüde değişebilir, bu da bu tür hücrelerin immünohistokimyasal boyama yoluyla tanımlanmasını zorlu bir çaba haline getirir. Aksine, aldehit dehidrogenaz 1A1 (ALDH1A1), CSC’ler de dahil olmak üzere hemen hemen tüm progenitör hücrelerde korunmuş ekspresyon profili nedeniyle, CSC’leri tanımlamak için mükemmel bir belirteç olarak ortaya çıkmıştır. ALDH1A1 izoformu, çeşitli endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonundan sorumlu olan 19 enzimden oluşan bir süper aileye aittir. Chan ve ark. yakın zamanda ALDH1A1 aktivitesinin tespiti için izoform seçici bir “açma” probu olan AlDeSense’i ve ayrıca hedef dışı boyamayı hesaba katmak için reaktif olmayan bir eşleştirme kontrol reaktifini (Ctrl-AlDeSense) geliştirdi. Bu izoform seçici aracın, K562 miyelojen lösemi hücrelerinde, mamosferlerde ve melanom kaynaklı CSC ksenogreftlerinde ALDH1A1 aktivitesinin tespiti yoluyla çok yönlü bir kimyasal araç olduğu zaten gösterilmiştir. Bu makalede, probun faydası, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde göreceli ALDH1A1 aktivitesinin belirlendiği ek florimetri, konfokal mikroskopi ve akış sitometri deneyleri ile gösterilmiştir.
Introduction
Kanser kök hücreleri (CSC’ler), kök hücre benzeri özellikler sergileyen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonudur1. Kanserli olmayan meslektaşlarına benzer şekilde, CSC’ler kendini yenilemek ve çoğalmak için olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. ATP bağlayıcı kaset taşıyıcılarının yukarı regülasyonu gibi diğer yerleşik mekanizmalarla birlikte, CSC’ler genellikle ilk cerrahi debulking çabalarından ve sonraki adjuvan tedaviden2 korunur. Tedavi direnci3, nüks4 ve metastaz5’teki kritik rolleri nedeniyle, CSC’ler kanser araştırmalarında bir öncelik haline gelmiştir. CSC’leri tanımlamak için kullanılabilecek çeşitli hücre yüzey antijenleri (örneğin, CD133) olmasına rağmen, 6, sitoplazmada bulunan aldehit dehidrojenazların (ALDH’ler) enzimatik aktivitesinden yararlanmak çekici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır7. ALDH’ler, reaktif endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonunu katalize etmekten sorumlu 19 enzimin bir üst ailesidir8.
Genel olarak, aldehit detoksifikasyonu, hücreleri istenmeyen çapraz bağlanma olaylarından ve kök hücre bütünlüğüne zarar verebilecek oksidatif stresten korumada çok önemlidir9. Dahası, 1A1 izoformu retinoik asit metabolizmasını kontrol eder ve bu da retinaldehit sinyali10 yoluyla gövdeyi etkiler. ALDH1A1 aktivitesini seçici olarak tespit etmek için küçük moleküllü aktivite tabanlı bir algılama (ABS) probu olan AlDeSense 11,12, yakın zamanda geliştirilmiştir. ABS tasarımları, bağlayıcı bir olaydan ziyade kimyasal bir değişiklik yoluyla analit tespiti yaparak, yüksek seçiciliğe ve hedef dışı tepkilerin azalmasına izin verir13,14,15,16. İzoform seçici florojenik probun tasarım prensibi, prob18’in floresan imzasını bastırmaya yarayan aldehit fonksiyonel grubundan kaynaklanan bir donör-fotoindüklenmiş elektron transferi (d-PeT) söndürme mekanizması17’ye dayanır. ALDH1A1 aracılı karboksilik aside dönüştürüldükten sonra, yüksek floresan bir ürün elde etmek için ışınımsal gevşemenin kilidi açılır. D-PeT söndürme hiçbir zaman% 100 verimli olmadığından, olası yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek artık floresan, bu tahlili oluştururken, eşleşen fotofiziksel özelliklere (örneğin, kuantum verimi) ve hücrelerde aynı sitoplazmik boyama modeline sahip yanıt vermeyen bir reaktif olan Ctrl-AlDeSense’in geliştirilmesi yoluyla göz önünde bulundurulmuştur. Birlikte kullanıldığında, bu benzersiz eşleştirme, yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri, florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla düşük seviyeler sergileyenlerden güvenilir bir şekilde ayırt edebilir. Birçok önemli avantaj, geleneksel immünohistokimyasal yöntemlere göre izoform seçici aktive edilebilir boyaların kullanımı ile ilişkilidir. Örneğin, CSC’lerin bir tümörün derinliklerine gömüldüğü varsayılmıştır ve bu nedenle büyük antikorlara göre küçük bir molekül için daha erişilebilirdir19. Ek olarak, ters çevrilmiş floresan ürün herhangi bir hücresel bileşeni kovalent olarak değiştirmez, yani bir CSC’yi değiştirilmemiş bir durumda bırakmak için yıkama döngüleri yoluyla kolayca çıkarılabilir. Son olarak, açılma yanıtı, NAD + kofaktörüne olan bağımlılığı nedeniyle, MTT testi gibi, yalnızca canlı hücreleri ve işlevleri tanımlar.
Şekil 1: AlDeSense’in floresan açılımını gösteren şematik. İzoform seçici boya, ALDH1A1 tarafından aktive edilir ve yumurtalık kanseri hücrelerinde yüksek ALDH1A1 aktivitesini florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla tanımlamak için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Geçmiş çalışmalarda, izoform seçici florojenik prob testi, K562 insan kronik lösemi hücrelerinde, MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde ve B16F0 murin melanom hücrelerinde ALDH düşük (ALDH-) hücrelerden ALDH yüksek (ALDH +) hücrelerini başarıyla tabakalaştırdı. Bu önemlidir, çünkü birçok kanser türü için yüksek ALDH1A1 protein ekspresyonu daha kötü bir klinik prognozu gösterir20. Bu, yüksek ALDH1A1 seviyelerinin, tedaviden kaçabilen, direnç geliştirebilen ve vücuda yayılabilen CSC’lerin göstergesi olduğunu varsaymaktadır. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri durumunda, tam tersi bulguyu bildiren çalışmalar vardır (yüksek ALDH1A1 ekspresyonu, hasta sağkalımının iyileşmesi ile bağlantılıdır)21,22,23,24. Bu ilk bakışta çelişkili görünse de, ekspresyon mutlaka tümör mikroortamındaki değişikliklerden (örneğin, pH akısı, oksijen gradyanları), NAD + kofaktör veya aldehit substratlarının mevcudiyeti, karboksilik asit seviyeleri (ürün inhibisyonu) ve enzim aktivitesini değiştirebilen translasyonel sonrası modifikasyonlardan etkilenebilecek enzim aktivitesi ile ilişkili değildir25 . Ek olarak, yumurtalık kanseri beş ana histolojik tipe (yüksek dereceli seröz, düşük dereceli seröz, endometrioid, berrak hücreli ve müsinöz) ayrılır ve bunların ALDH1A1 aktivitesinin değişken seviyelerine sahip olacağını varsayıyoruz26. Yumurtalık tümörlerinde ALDH1A1 aktivitesini araştırmak amacıyla, yukarıda belirtilen farklı histolojik tiplere ait beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 + popülasyonlarını tanımlamak için izoform seçici bir florojenik prob testi kullanılmıştır. Bu çalışmada test edilen hücre hatları, berrak hücreli ve seröz histotipleri kapsayan BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 ve PEO4 hücrelerini içerir. Burada, probun çok yönlülüğü ve genellenebilirliği, diğer ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarında ve hasta örneklerinde benzer çalışmalar yapmak isteyen araştırmacılar için CSC’leri tanımlamak için vurgulanmıştır. AlDeSense’in kullanımı, karmaşık doku mikro ortamlarında CSC bakımında yer alan biyokimyasal yollara ışık tutacak ve potansiyel olarak prognozu belirlemek ve kanser saldırganlığını ölçmek için klinik bir araç olarak hizmet edecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pan-seçicilik, birçok ALDH probunun önemli bir sınırlamasıdır; Bununla birlikte, son zamanlarda birkaç izoform seçici örnek bildirilmiştir 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Bu ça…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JC’ye R35GM133581) ve Illinois Lisansüstü Bursu’ndaki Kanser Merkezi (SG’ye verildi) tarafından desteklenmiştir. JC, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı’na destekleri için teşekkür eder. Yazarlar, Dr. Thomas E. Bearood’a AlDeSense ve AlDeSense’nin stoklarının hazırlanmasına yaptığı ilk katkı için teşekkür eder. Oliver D. Pichardo Peguero ve Joseph A. Forzano’ya çeşitli sentetik öncüllerin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Caov-3, IGROV-1 ve PEO4 hücreleri için Prof. Dr. Erik Nelson’a (Moleküler ve Bütünleştirici Fizyoloji Anabilim Dalı, UIUC) teşekkür ederiz. BG-1 hücreleri için Prof. Paul Hergenrother’e (UIUC Kimya Bölümü) teşekkür ederiz. Carl R. Woese Genomik Biyoloji Enstitüsü’ndeki Temel Tesislere, Zeiss LSM 700 Konfokal Mikroskop ve ilgili yazılıma erişim için teşekkür ederiz. BD LSR II CMtO Analizörüne erişim için Flow Sitometri Tesisi’ne teşekkür ederiz. Dr. Sandra McMasters’a ve Hücre Medyası Tesisi’ne hücre kültürü medyasının hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
