Applicazione di AlDeSense per stratificare cellule tumorali ovariche basate sull'attività dell'aldeide deidrogenasi 1A1
Summary
I metodi per misurare l’attività di ALDH1A1 nelle cellule vive sono fondamentali nella ricerca sul cancro a causa del suo status di biomarcatore della staminalità. In questo studio, abbiamo impiegato una sonda fluorogenica isoform-selettiva per determinare i livelli relativi di attività di ALDH1A1 in un pannello di cinque linee cellulari di cancro ovarico.
Abstract
La recidiva dopo il trattamento del cancro è spesso attribuita alla persistenza di una sottopopolazione di cellule tumorali note come cellule staminali tumorali (CSC), che sono caratterizzate dalla loro notevole capacità di iniziare il tumore e di auto-rinnovarsi. A seconda dell’origine del tumore (ad esempio, ovaie), il profilo del biomarcatore di superficie CSC può variare notevolmente, rendendo l’identificazione di tali cellule tramite colorazione immunoistochimica uno sforzo impegnativo. Al contrario, l’aldeide deidrogenasi 1A1 (ALDH1A1) è emersa come un eccellente marcatore per identificare le CSC, grazie al suo profilo di espressione conservato in quasi tutte le cellule progenitrici, comprese le CSC. L’isoforma ALDH1A1 appartiene a una superfamiglia di 19 enzimi responsabili dell’ossidazione di varie aldeidi endogene e xenobiotiche ai corrispondenti prodotti di acido carbossilico. Chan et al. hanno recentemente sviluppato AlDeSense, una sonda “turn-on” selettiva per l’isoforma per il rilevamento dell’attività di ALDH1A1, nonché un reagente di controllo di corrispondenza non reattivo (Ctrl-AlDeSense) per tenere conto della colorazione fuori bersaglio. Questo strumento selettivo per le isoforme ha già dimostrato di essere uno strumento chimico versatile attraverso la rilevazione dell’attività di ALDH1A1 nelle cellule di leucemia mieloide K562, nelle mammosfere e negli xenotrapianti CSC derivati dal melanoma. In questo articolo, l’utilità della sonda è stata mostrata attraverso ulteriori esperimenti di fluorimetria, microscopia confocale e citometria a flusso in cui la relativa attività di ALDH1A1 è stata determinata in un pannello di cinque linee cellulari di cancro ovarico.
Introduction
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una sottopopolazione di cellule tumorali che presentano proprietà simili alle cellule staminali1. Simili alle loro controparti non cancerose, le CSC possiedono la straordinaria capacità di auto-rinnovarsi e proliferare. Insieme ad altri meccanismi incorporati, come la sovraregolazione dei trasportatori di cassette che legano ATP, le CSC sono spesso risparmiate dagli sforzi iniziali di debulking chirurgico, nonché dalla successiva terapia adiuvante2. A causa del loro ruolo critico nella resistenza al trattamento3, recidiva4 e metastasi5, le CSC sono diventate una priorità nella ricerca sul cancro. Sebbene ci sia una varietà di antigeni di superficie cellulare (ad esempio, CD133) che possono essere utilizzati per identificare le CSCs6, sfruttare l’attività enzimatica delle aldeidi deidrogenasi (ALDH) trovate nel citoplasma è emerso come un’alternativa attraente7. Gli ALDH sono una superfamiglia di 19 enzimi responsabili della catalizzazione dell’ossidazione delle aldeidi reattive endogene e xenobiotiche nei corrispondenti prodotti di acido carbossilico8.
In generale, la disintossicazione da aldeide è fondamentale per proteggere le cellule da eventi di reticolazione indesiderati e stress ossidativo che possono danneggiare l’integrità delle cellule staminali9. Inoltre, l’isoforma 1A1 controlla il metabolismo dell’acido retinoico, che a sua volta influenza la staminalità attraverso la segnalazione10 della retinaldeide. AlDeSense 11,12, una sonda di rilevamento basato sull’attività (ABS) a piccole molecole per rilevare selettivamente l’attività di ALDH1A1, è stata recentemente sviluppata. I progetti ABS ottengono il rilevamento dell’analita attraverso un cambiamento chimico piuttosto che un evento di legame, consentendo un’elevata selettività e una riduzione delle risposte fuori bersaglio13,14,15,16. Il principio di progettazione della sonda fluorogenica selettiva per isoforme si basa su un meccanismo di spegnimento17 del trasferimento elettronico fotoindotto da donatore (d-PeT), originato dal gruppo funzionale aldeidico, che serve a sopprimere la firma fluorescente della sonda18. Dopo la conversione mediata da ALDH1A1 nell’acido carbossilico, il rilassamento radiativo viene sbloccato per produrre un prodotto altamente fluorescente. Poiché la tempra d-PeT non è mai efficiente al 100%, la fluorescenza residua che può portare a possibili risultati falsi positivi è stata considerata quando si stabilisce questo test attraverso lo sviluppo di Ctrl-AlDeSense, un reagente non reattivo con caratteristiche fotofisiche corrispondenti (ad esempio, resa quantica) e un identico modello di colorazione citoplasmatica nelle cellule. Se utilizzato in tandem, questo accoppiamento unico può distinguere in modo affidabile le cellule con elevata attività di ALDH1A1 da quelle che presentano bassi livelli tramite fluorimetria, imaging molecolare e citometria a flusso. Diversi vantaggi chiave sono associati all’uso di coloranti attivabili isoform-selettivi rispetto ai metodi immunoistochimici tradizionali. Ad esempio, si ipotizza che le CSC siano sepolte in profondità all’interno di un tumore, e quindi sono più accessibili a una piccola molecola rispetto ai grandi anticorpi19. Inoltre, il prodotto fluorescente capovolto non modifica covalentemente alcun componente cellulare, il che significa che può essere facilmente rimosso tramite cicli di lavaggio per lasciare un CSC in uno stato non modificato. Infine, la risposta di accensione identifica solo cellule e funzioni vitali, proprio come il test MTT, a causa della sua dipendenza dal cofattore NAD +.
Figura 1: Schema che dimostra l’accensione fluorescente di AlDeSense. Il colorante isoform-selettivo è attivato da ALDH1A1 e può essere utilizzato per identificare un’elevata attività di ALDH1A1 nelle cellule tumorali ovariche tramite fluorimetria, imaging molecolare e citometria a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
In lavori precedenti, il test della sonda fluorogenica selettiva per isoforme ha stratificato con successo cellule ALDH alte (ALDH +) da cellule ALDH basse (ALDH-) in cellule di leucemia cronica umana K562, cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 e cellule di melanoma murino B16F0. Questo è importante perché, per molti tipi di cancro, un’elevata espressione della proteina ALDH1A1 significa una prognosi clinica peggiore20. Ciò presuppone che livelli elevati di ALDH1A1 siano indicativi di CSC che possono eludere il trattamento, sviluppare resistenza e diffondersi in tutto il corpo. Tuttavia, nel caso del carcinoma ovarico, ci sono studi che riportano il risultato opposto (un’elevata espressione di ALDH1A1 è legata a una migliore sopravvivenza della paziente)21,22,23,24. Sebbene ciò possa sembrare contraddittorio a prima vista, l’espressione non è necessariamente correlata all’attività enzimatica, che può essere influenzata da cambiamenti nel microambiente tumorale (ad esempio, flusso di pH, gradienti di ossigeno), disponibilità del cofattore NAD+ o substrati aldeidici, livelli di acidi carbossilici (inibizione del prodotto) e modifiche post-traduzionali che possono alterare l’attività enzimatica25 . Inoltre, il carcinoma ovarico è diviso in cinque tipi istologici principali (sieroso di alto grado, sieroso di basso grado, endometrioide, a cellule chiare e mucinoso), che ipotizziamo saranno caratterizzati da livelli variabili di attività ALDH1A126. Con l’obiettivo di studiare l’attività di ALDH1A1 nei tumori ovarici, è stato utilizzato un saggio di sonda fluorogenica selettiva per identificare le popolazioni di ALDH1A1+ in un pannello di cinque linee cellulari di cancro ovarico appartenenti ai diversi tipi istologici sopra menzionati. Le linee cellulari testate in questo studio includono cellule BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 e PEO4, che coprono istotipi a cellule chiare e sierosi. Qui, la versatilità e la generalizzabilità della sonda è stata evidenziata per identificare le CSC per i ricercatori che cercano di eseguire studi simili in altre linee cellulari tumorali immortalizzate e campioni di pazienti. L’uso di AlDeSense farà luce sui percorsi biochimici coinvolti nel mantenimento delle CSC in microambienti tissutali complessi e potenzialmente servirà come strumento clinico per determinare la prognosi e misurare l’aggressività del cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La panselettività è una delle principali limitazioni di molte sonde ALDH; Tuttavia, sono stati recentemente riportati diversi esempi selettivi per isoforme 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R35GM133581 a JC) e dal Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (assegnato a SG). JC ringrazia la Fondazione Camille e Henry Dreyfus per il supporto. Gli autori ringraziano il Dr. Thomas E. Bearrood per il suo contributo iniziale alla preparazione delle scorte di AlDeSense e AlDeSense AM. Ringraziamo Oliver D. Pichardo Peguero e Joseph A. Forzano per la loro assistenza nella preparazione di vari precursori sintetici. Ringraziamo il Prof. Erik Nelson (Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Integrativa, UIUC) per le cellule Caov-3, IGROV-1 e PEO4. Ringraziamo il Prof. Paul Hergenrother (Dipartimento di Chimica, UIUC) per le cellule BG-1. Ringraziamo le strutture principali del Carl R. Woese Institute for Genomic Biology per l’accesso al microscopio confocale Zeiss LSM 700 e al software corrispondente. Si ringrazia la Flow Cytometry Facility per l’accesso all’analizzatore BD LSR II CMtO. Ringraziamo la dott.ssa Sandra McMasters e la Cell Media Facility per l’assistenza nella preparazione dei terreni di coltura cellulare.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
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