Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1

Summary

Les méthodes de mesure de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules vivantes sont essentielles dans la recherche sur le cancer en raison de son statut de biomarqueur de la souches. Dans cette étude, nous avons utilisé une sonde fluorogénique sélective isoforme pour déterminer les niveaux relatifs d’activité ALDH1A1 dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Abstract

La rechute après un traitement anticancéreux est souvent attribuée à la persistance d’une sous-population de cellules tumorales appelées cellules souches cancéreuses (CSC), qui se caractérisent par leur remarquable capacité d’initiation tumorale et d’auto-renouvellement. Selon l’origine de la tumeur (par exemple, les ovaires), le profil de biomarqueur de surface du CSC peut varier considérablement, ce qui rend l’identification de ces cellules par coloration immunohistochimique une entreprise difficile. Au contraire, l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 (ALDH1A1) est apparue comme un excellent marqueur pour identifier les CSC, en raison de son profil d’expression conservé dans presque toutes les cellules progénitrices, y compris les CSC. L’isoforme ALDH1A1 appartient à une superfamille de 19 enzymes responsables de l’oxydation de divers aldéhydes endogènes et xénobiotiques en produits d’acide carboxylique correspondants. Chan et al. ont récemment développé AlDeSense, une sonde isoforme-sélective pour la détection de l’activité ALDH1A1, ainsi qu’un réactif de contrôle d’appariement non réactif (Ctrl-AlDeSense) pour tenir compte de la coloration hors cible. Cet outil sélectif des isoformes s’est déjà avéré être un outil chimique polyvalent grâce à la détection de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules leucémiques myéloïdes K562, les mammosphères et les xénogreffes CSC dérivées du mélanome. Dans cet article, l’utilité de la sonde a été démontrée par des expériences supplémentaires de fluorimétrie, de microscopie confocale et de cytométrie en flux où l’activité relative de l’ALDH1A1 a été déterminée dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Introduction

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une sous-population de cellules tumorales qui présentent des propriétés semblables à celles des cellules souches¹. À l’instar de leurs homologues non cancéreux, les CSC possèdent une capacité extraordinaire de se renouveler et de proliférer. Avec d’autres mécanismes intégrés, tels que la régulation positive des transporteurs de cassettes liant l’ATP, les CSC sont souvent épargnés par les efforts initiaux de réduction tumorale chirurgicale, ainsi que par le traitement adjuvant ultérieur². En raison de leur rôle essentiel dans la résistance au traitement³, la rechute⁴ et les métastases⁵, les CSC sont devenus une priorité dans la recherche sur le cancer. Bien qu’il existe une variété d’antigènes de surface cellulaire (p. ex. CD133) qui peuvent être utilisés pour identifier les CSC⁶, tirer parti de l’activité enzymatique des aldéhydes déshydrogénases (ALDH) trouvées dans le cytoplasme est apparu comme une alternative intéressante⁷. Les ALDH sont une superfamille de 19 enzymes responsables de catalyser l’oxydation des aldéhydes endogènes et xénobiotiques réactifs en produits d’acide carboxylique^{correspondants 8}.

En général, la détoxification des aldéhydes est cruciale pour protéger les cellules contre les événements de réticulation indésirables et le stress oxydatif qui peuvent endommager l’intégrité des cellules souches⁹. De plus, l’isoforme 1A1 contrôle le métabolisme de l’acide rétinoïque, qui à son tour influence la souche via la signalisation du rétinaldéhyde¹⁰. AlDeSense ^11,12, une sonde de détection basée sur l’activité (ABS) à petites molécules pour détecter sélectivement l’activité ALDH1A1^, a récemment été développée. Les conceptions ABS permettent la détection de l’analyte par un changement chimique plutôt que par un événement de liaison, ce qui permet une sélectivité élevée et une diminution des réponses hors cible^13,14,15,16. Le principe de conception de la sonde fluorogénique isoforme-sélective repose sur un mécanisme de trempe par transfert d’électrons photoinduit par donneur (d-PeT)¹⁷, issu du groupe fonctionnel aldéhyde, qui sert à supprimer la signature fluorescente de la sonde¹⁸. Lors de la conversion médiée par ALDH1A1 en acide carboxylique, la relaxation radiative est débloquée pour produire un produit hautement fluorescent. Étant donné que la trempe d-PeT n’est jamais efficace à 100 %, la fluorescence résiduelle pouvant conduire à d’éventuels résultats faussement positifs a été prise en compte lors de l’établissement de ce test grâce au développement de Ctrl-AlDeSense, un réactif non réactif présentant des caractéristiques photophysiques correspondantes (p. ex., rendement quantique) et un schéma de coloration cytoplasmique identique dans les cellules. Lorsqu’il est utilisé en tandem, cet appariement unique peut distinguer de manière fiable les cellules à forte activité ALDH1A1 de celles qui présentent de faibles niveaux via la fluorimétrie, l’imagerie moléculaire et la cytométrie en flux. Plusieurs avantages clés sont associés à l’utilisation de colorants activables isoformels par rapport aux méthodes immunohistochimiques traditionnelles. Par exemple, on suppose que les CSC sont enfouis profondément dans une tumeur et sont donc plus accessibles à une petite molécule que les gros anticorps¹⁹. De plus, le produit fluorescent retourné ne modifie pas de manière covalente un composant cellulaire, ce qui signifie qu’il peut être facilement éliminé par des cycles de lavage pour laisser un CSC dans un état non modifié. Enfin, la réponse d’activation n’identifie que les cellules et les fonctions viables, tout comme le test MTT, en raison de sa dépendance au cofacteur NAD ⁺.

Figure 1 : Schéma montrant l’activation fluorescente d’AlDeSense. Le colorant isoforme-sélectif est activé par ALDH1A1 et peut être utilisé pour identifier une activité élevée d’ALDH1A1 dans les cellules cancéreuses de l’ovaire par fluorimétrie, imagerie moléculaire et cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans des travaux antérieurs, le test de sonde fluorogénique sélective isoforme a réussi à stratifier les cellules ALDH élevées (ALDH+) des cellules ALDH faibles (ALDH-) dans les cellules leucémiques chroniques humaines K562, les cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 et les cellules de mélanome murin B16F0. Ceci est important car, pour de nombreux types de cancer, une expression élevée de la protéine ALDH1A1 signifie un pronostic clinique moins sombre²⁰. Cela suppose que des niveaux élevés d’ALDH1A1 sont indicatifs de CSC qui peuvent échapper au traitement, développer une résistance et se propager dans tout le corps. Cependant, dans le cas du cancer de l’ovaire, certaines études rapportent le résultat inverse (une expression élevée d’ALDH1A1 est liée à une amélioration de la survie des patientes)^21,22,23,24. Bien que cela puisse sembler contradictoire à première vue, l’expression n’est pas nécessairement corrélée à l’activité enzymatique, qui peut être influencée par des changements dans le microenvironnement tumoral (par exemple, flux de pH, gradients d’oxygène), la disponibilité du cofacteur NAD⁺ ou des substrats d’aldéhyde, les niveaux d’acides carboxyliques (inhibition du produit) et les modifications post-traductionnelles qui peuvent modifier l’activité enzymatique²⁵ . De plus, le cancer de l’ovaire est divisé en cinq types histologiques principaux (séreuse de haut grade, séreuse de bas grade, endométrioïde, à cellules claires et mucineuse), dont nous supposons qu’elles présenteront des niveaux variables d’activité ALDH1A1²⁶. Dans le but d’étudier l’activité de l’ALDH1A1 dans les tumeurs ovariennes, un test de sonde fluorogénique sélective isoforme a été utilisé pour identifier les populations ALDH1A1+ dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire appartenant aux différents types histologiques mentionnés ci-dessus. Les lignées cellulaires testées dans cette étude comprennent des cellules BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 et PEO4, couvrant les histotypes à cellules claires et séreuses. Ici, la polyvalence et la généralisabilité de la sonde ont été soulignées pour identifier les CSC pour les chercheurs qui cherchent à effectuer des études similaires sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses immortalisées ainsi que sur des échantillons de patients. L’utilisation d’AlDeSense permettra de faire la lumière sur les voies biochimiques impliquées dans le maintien du SCC dans des microenvironnements tissulaires complexes et pourrait servir d’outil clinique pour déterminer le pronostic et mesurer l’agressivité du cancer.

Protocol

1. Mesurer l’activité totale de l’ALDH1A1 dans les homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaire par fluorimétrie Décongeler 1 × 106 cellules dans une fiole de culture cellulaire T25 dans 5 mL des milieux de culture cellulaire suivants :IGROV-1 et PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S). BG-1 et Caov-3 : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (…

Representative Results

Activité totale de l’ALDH1A1 des homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaireLes activations moyennes de pli pour chaque lignée cellulaire obtenue à partir de ce test sont les suivantes: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); et OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figure 2). <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jp…

Discussion

La pansélectivité est une limitation majeure de nombreuses sondes ALDH ; Cependant, plusieurs exemples sélectifs d’isoformes ont récemment été rapportés 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.^<…

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthesized in-house
BG-1			A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask	Thermo Fisher Scientific	130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Provided by UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System	Thermo Fisher Scientific	155383
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin			Prepared by UIUC cell media facility