Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Summary

Представлен протокол модифицированного метода иммуноферментного анализа для количественного измерения двух компонентов остатков внеклеточной ловушки нейтрофилов: конъюгированной ДНК миелопероксидазы и конъюгированных ДНК нейтрофильной эластазы, полученных из активированных нейтрофилов.

Abstract

Некоторые раздражители, такие как микроорганизмы, заставляют нейтрофилы высвобождать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые в основном представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из ДНК с гранулярными белками, такими как миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза (НЭ), а также цитоплазматические и цитоскелетные белки. Несмотря на то, что интерес к НВЛ в последнее время возрос, не существует чувствительного и надежного метода анализа для измерения НВЛ в клинических условиях. В данной статье описан модифицированный сэндвич-фермент-связанный иммуносорбентный анализ для количественного измерения двух компонентов циркулирующих НВЛ, комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК, которые являются специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ. В анализе используются специфические моноклональные антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. МПО или НЭ связывается с одним участком захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. Этот анализ показывает хорошую линейность и высокую межпробирную и внутрипробную точность. Мы использовали его у 16 пациентов с COVID-19 с сопутствующим острым респираторным дистресс-синдромом и обнаружили, что плазменные концентрации МПО-ДНК и НЭ-ДНК были достоверно выше, чем в плазме, полученной от здоровых контрольных групп. Этот детектирующий анализ является надежным, высокочувствительным и полезным методом для исследования характеристик НВЛ в плазме крови и надосадочной жидкости культуры.

Introduction

В статье описан метод количественной оценки образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ) в биологических жидкостях с помощью сэндвич-ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА) для выявления комплексов миелопероксидазы (МПО) и нейтрофильной эластазы (НЭ) с ДНК ^1,2. НВЛ состоят из ДНК-каркаса, украшенного антимикробными протеазами, происходящими из гранул нейтрофилов ^3,4. Комплексы МПО-ДНК и НЭ-ДНК являются важными и специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ ^3,4.

Помимо своей важной физиологической роли в противомикробной защите³, НВЛ также оказывают различные патологические эффекты^4,5, включая стимулирование тромбогенеза⁶ и ухудшение сепсиса⁷. Соответственно, в последнее время НЭО привлекают к себе внимание. Тем не менее, количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей из-за отсутствия чувствительного и надежного метода количественного анализа.

Существует несколько методов, в том числе прямое измерение НВЛ с помощью флуоресцентной микроскопии^8,9 и проточной цитометрии 10, а также косвенное измерение циркулирующей внеклеточной ДНК, нуклеосом и цитруллинированного гистонов H3^, но каждый метод имеет свои преимущества и ограничения¹¹. Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный микроскопический метод специфичен для НВЛ и четко показывает локализацию и степень образования НВЛ, образцы ограничиваются биопсийной тканью и секретируемыми материалами. Более того, этот метод должен выполняться квалифицированными исследователями и требует длительного времени для получения результатов. Измерение циркулирующих уровней компонентов, связанных с НВЛ, с помощью проточной цитометрии является простым и быстрым получением результатов; однако этот метод не является специфичным для NETs¹².

Мы¹³ и другие^1,2 разработали высокочувствительный и надежный анализ для измерения циркулирующих компонентов НВЛ, МПО-конъюгированной или NE-конъюгированной ДНК, в плазме крови человека с помощью модифицированной методики ИФА^, которая использует специфические антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. Этот анализ также может быть использован ex vivo для идентификации компонентов НВЛ в супернатантах клеточных культур, высвобождаемых активированными нейтрофилами в ответ на стимуляцию форболом-12-миристат-13-ацетатом (ПМА).

Protocol

Данное исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено институциональными наблюдательными советами Медицинского университета Айти (2017-H341, 2019-H137). От каждого участника было получено письменное информированное согласие. 1. Приготов?…

Representative Results

В этом методе использовали сэндвич-ИФА с моноклональными антителами к МПО, анти-НЭ и анти-ДНК для измерения МПО-ассоциированной и НЭ-ассоциированной ДНК (рис. 1). В этом методе лунки микротитровой пластины покрывали МПО-специфическим или НЭ-специфическим моноклональным ?…

Discussion

Нами описан метод сэндвич-ИФА, при котором МПО или НЭ связываются с одним сайтом захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. После промывки «бутерброд» завершается инкубацией образцов с пероксидаза-ассоциированным анти-ДНК моноклона?…

Materials

1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.