我们提出了一种改进的夹心酶联免疫吸附测定技术方案,以定量测量中性粒细胞细胞外捕获残留物的两种成分,髓过氧化物酶偶联-DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶偶联 DNA 复合物,来源于活化的中性粒细胞。
某些刺激,如微生物,导致中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱(NET),其基本上是由DNA与颗粒蛋白组成的网状结构,如髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白(NE),以及细胞质和细胞骨架蛋白。尽管最近对NETs的兴趣有所增加,但没有灵敏,可靠的测定方法可用于在临床环境中测量NET。本文描述了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法,用于定量测量循环 NET 的两种成分,MPO-DNA 和 NE-DNA 复合物,它们是 NET 的特定成分,并作为 NET 的分解产物释放到细胞外空间。该测定使用用于MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体和DNA特异性检测抗体。MPO 或 NE 在含有 MPO-DNA 或 NE-DNA 复合物的样品初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。该测定显示出良好的线性和高测定间和测定内精度。我们在16名伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中使用了它,发现MPO-DNA和NE-DNA的血浆浓度明显高于从健康对照获得的血浆。该检测法是研究人血浆和培养上清液中NET特征的可靠、高灵敏度和有用的方法。
本文概述了一种定量生物体液中中性粒细胞细胞外捕获 (NET) 形成的方法,方法是使用夹心酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 检测髓过氧化物酶 (MPO) 和中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) 与 DNA 1,2 的复合物。NET由装饰有源自中性粒细胞颗粒3,4的抗菌蛋白酶的DNA骨架组成。MPO-DNA和NE-DNA复合物都是NET的重要和特异性成分,并作为NETs的分解产物释放到细胞外空间3,4。
NETs除了在抗菌防御中起重要的生理作用3外,还具有多种病理作用4,5,包括促进血栓形成6 和脓毒症恶化7。因此,NET最近引起了人们的关注。然而,由于缺乏灵敏、可靠的定量测定方法,NET的 体内 定量已被证明具有挑战性。
有几种方法可用,包括通过荧光显微镜8,9和流式细胞术10直接测量NET,以及间接测量循环游离DNA,核小体和瓜氨酸组蛋白H3,但每种方法都有自己的优点和局限性11。尽管免疫荧光显微镜方法特定于NETs,并且清楚地显示了NET的定位和形成程度,但样本仅限于活检组织和分泌物质。此外,该方法需要由熟练的研究人员进行,并且需要很长时间才能获得结果。通过流式细胞术测量NET相关成分的循环水平很容易,并且可以快速提供结果;但是,该方法并非特定于NETs 12。
我们13 和其他人 1,2 开发了一种高度灵敏且可靠的检测方法,用于使用改进的 ELISA 技术测量人血浆中循环的 NET 组分、MPO 偶联或 NE 偶联 DNA,该技术使用 MPO 或 NE 的特异性抗体作为捕获抗体和 DNA 特异性检测抗体。该测定法还可用于离体鉴定活化的中性粒细胞响应佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 (PMA) 刺激释放的细胞培养上清液中的 NET 组分。
我们已经描述了一种夹心ELISA方法,其中MPO或NE在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样品的初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。洗涤后,通过将样品与过氧化物酶相关的抗DNA单克隆抗体孵育来完成“三明治”。去除未结合的二抗后,通过添加显色ABTS过氧化物酶底物来检测结合的过氧化物酶偶联物,其产生可溶性终产物,可以在405nm处通过分光光度法读取。良好的线性、较高的测定间和测定内精密度?…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Huq Muhammad Aminul博士在审阅手稿时提供的帮助。
1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |