Summary

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Abstract

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Introduction

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN 1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles 3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE 3,4.

Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne3, les TNE ont également divers effets pathologiques4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse6 et l’aggravation de la septicémie7. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.

Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites11. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE12.

Nous13 et al. 1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).

Protocol

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu. 1. Préparation des réactifs REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous. Tampon de revêtement :<…

Representative Results

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de …

Discussion

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Huq Muhammad Aminul pour leur aide dans la révision du manuscrit.

Materials

1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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