Summary

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Published: May 12, 2023
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Summary

本稿では,活性化好中球由来の好中球細胞外トラップ残骸の2つの成分,ミエロペルオキシダーゼ抱合型DNAと好中球エラスターゼ抱合型DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法のプロトコルについて紹介する。

Abstract

微生物などの特定の刺激により、好中球は好中球細胞外トラップ(NET)を放出しますが、これは基本的に、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)や好中球エラスターゼ(NE)などの顆粒タンパク質を含むDNAと細胞質および細胞骨格タンパク質で構成されるウェブ様構造です。近年NETへの関心が高まっていますが、臨床現場でNETを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイ法はありません。本稿では、NETの特定の成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出される循環NETの2つの成分であるMPO-DNAおよびNE-DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明します。このアッセイでは、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的なモノクローナル抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用します。MPOまたはNEは、MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、捕捉抗体の1つの部位に結合します。このアッセイは、良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度を示します。急性呼吸窮迫症候群を伴うCOVID-19患者16例に使用したところ、MPO-DNAおよびNE-DNAの血漿中濃度が健常対照から得られた血漿中よりも有意に高いことがわかりました。この検出アッセイは、ヒト血漿および培養上清中のNETsの特性を調べるための信頼性が高く、高感度で有用な方法です。

Introduction

本稿では、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてミエロペルオキシダーゼ(MPO)と好中球エラスターゼ(NE)とDNA 1,2の複合体を検出することにより、体液中の好中球細胞外トラップ(NET)形成を定量する方法について概説します。NETは、好中球顆粒に由来する抗菌プロテアーゼで装飾されたDNA骨格で構成されています3,4。MPO-DNA複合体とNE-DNA複合体はどちらもNETの重要な特異的成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出されます3,4

NETは、抗菌防御における重要な生理学的役割3に加えて、血栓形成6の促進や敗血症7の悪化など、さまざまな病理学的効果4,5も持っています。そこで、最近はNETが注目されています。それにもかかわらず、NETのin vivo定量は、高感度で信頼性の高い定量アッセイ法がないため、困難であることが証明されています。

蛍光顕微鏡8,9およびフローサイトメトリー10によるNETの直接測定や、循環無細胞DNA、ヌクレオソーム、およびシトルリン化ヒストンH3の間接測定など、いくつかの方法が利用可能ですが、それぞれの方法には独自の利点と制限があります11。免疫蛍光顕微鏡法はNETに特異的であり、NET形成の局在と程度を明確に示していますが、サンプルは生検組織と分泌材料に限定されています。さらに、この方法は熟練した研究者が行う必要があり、結果が得られるまでに長い時間を必要とします。フローサイトメトリーによるNET関連成分の循環レベルの測定は簡単で、迅速に結果が得られます。ただし、このメソッドは NET12 に固有のものではありません。

We13およびその他1,2は、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的な抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用する修正ELISA技術を用いて、ヒト血漿中の循環NET成分であるMPO結合またはNE結合DNAを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイを開発しました。このアッセイは、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)刺激に応答して活性化好中球によって放出される細胞培養上清中のNET成分を同定するためにex vivoで使用することもできます。

Protocol

本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、愛知医科大学の治験審査委員会(2017-H341、2019-H137)で承認されました。書面によるインフォームドコンセントは各参加者から得られた。 1. 試薬調製 注:サンドイッチELISAアッセイを実施するために、試薬は以下のように調製される。 コーティングバッファー:0.1 mol/Lの炭酸水素塩緩…

Representative Results

この方法では、抗MPO、抗NE、および抗DNAモノクローナル抗体を含むサンドイッチELISAを使用して、MPO関連およびNE関連DNAを測定しました(図1)。この方法では、マイクロタイタープレートのウェルをMPO特異的またはNE特異的モノクローナル抗体でコーティングして、DNA関連MPOおよびDNA関連NE、ならびに非DNA関連MPOおよびNEを捕捉した。アッセイ内変動係数(CV)を計算するために…

Discussion

MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、MPOまたはNEがキャプチャ抗体の1つの部位に結合するサンドイッチELISA法について説明しました。洗浄後、サンプルをペルオキシダーゼ関連抗DNAモノクローナル抗体と共にインキュベートすることによって「サンドイッチ」が完成する。未結合の二次抗体を除去した後、発色性ABTSペルオキシダーゼ基質を添加することによ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、原稿のレビューを支援してくれたHuq Muhammad Aminul博士に感謝します。

Materials

1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

References

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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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