Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos
Summary
Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.
Abstract
A imunoterapia com anticorpos antígeno-específicos ou inibidores de checkpoints imunológicos revolucionou a terapia do câncer de mama. Células de câncer de mama que expressam o receptor HER2 do fator de crescimento epidérmico podem ser alvo do anticorpo anti-HER-2 trastuzumabe. A citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) é um importante mecanismo implicado na ação antitumoral do HER-2. O trastuzumabe ligado às células cancerosas pode ser reconhecido pelos receptores Fc das células efetoras do ADCC (por exemplo, células natural killer (NK), macrófagos e granulócitos), desencadeando a atividade citotóxica dessas células imunes levando à morte das células cancerígenas. Nós nos propusemos a desenvolver um ensaio baseado em imagem para a quantificação de ADCC para identificar novos compostos moduladores do ADCC por triagem de alto conteúdo. No ensaio, células de câncer de mama JIMT-1 superexpressando HER2 são co-cultivadas com células NK-92 na presença de trastuzumabe, e a morte da célula-alvo é quantificada por microscopia automatizada e análise quantitativa de imagens. As células-alvo distinguem-se das células efetoras com base em sua fluorescência EGFP. Mostramos como bibliotecas de compostos podem ser testadas no ensaio para identificar drogas moduladoras do ADCC. Para este propósito, uma placa de teste de biblioteca de compostos foi montada usando produtos químicos finos selecionados aleatoriamente fora da prateleira do laboratório. Três compostos desestabilizadores de microtúbulos (colchicina, vincristina, podofilotoxina) que devem interferir na migração e degranulação das células NK também foram incluídos na biblioteca de testes. A tela de teste identificou todos os três compostos de controle positivo como acertos que comprovam a adequação do método para identificar drogas modificadoras do ADCC em uma biblioteca química. Com este ensaio, telas de bibliotecas de compostos podem ser realizadas para identificar compostos que aumentam o ADCC que poderiam ser usados como agentes terapêuticos adjuvantes para o tratamento de pacientes recebendo imunoterapias anticâncer. Além disso, o método também pode ser usado para identificar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis inibidores do ADCC de drogas terapêuticas tomadas por pacientes com câncer para diferentes indicações.
Introduction
A imunoterapia com anticorpos anticâncer, inibidores de checkpoints imunes ou células T (CAR-T) que expressam receptores de antígenos quiméricos representa uma abordagem poderosa para o tratamento do câncer 1,2,3. O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) utilizado no tratamento do câncer de mama em estádio inicial ou metastático positivo para HER-2, bem como do câncer gástrico metastático positivo para HER-2 4,5,6. Atua principalmente inibindo o efeito estimulador da proliferação do fator de crescimento epidérmico4. Tem sido relatado, no entanto, que o trastuzumabe desencadeia eficientemente a morte de células cancerígenas, mesmo que as células cancerosas tenham perdido sua responsividade à estimulação de HER-27. Esse efeito paradoxal do anticorpo é devido à citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC)7. O ADCC pode ser mediado por células natural killer (NK), granulócitos e macrófagos conhecidos coletivamente como células efetoras do ADCC 8,9. Se um anticorpo, como o trastuzumabe, se liga às células tumorais, então essas células efetoras usam seus receptores Fc para se ligar à região constante (Fc) do anticorpo. O anticorpo faz a ponte entre as células tumorais e as células efetoras do receptor Fc, desencadeando a liberação de seus mediadores citotóxicos10. As células natural killer liberam a carga citotóxica de seus grânulos contendo perforina para gerar poros na membrana da célula-alvo e granzima (desencadeando vias de sinalização de morte celular) na sinapse imune levando à apoptose das células cancerosas (ver Figura 1).
Figura 1: Interações entre efetor e célula-alvo no ADCC. O receptor Fcγ de superfície celular da célula NK efetora reconhece a região Fc do anticorpo anti-HER2 trastuzumabe específico para a molécula HER2 expressa na superfície da célula tumoral. Assim, a chamada sinapse imunológica se estabelece entre as duas células, induzindo a exocitose dirigida dos grânulos citotóxicos da célula efetora. As moléculas de perforina e granzima liberadas acabam resultando em apoptose da célula-alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vários ensaios foram previamente desenvolvidos para quantificar a citotoxicidade, incluindo o ADCC. O padrão-ouro é o método de liberação radioativa de cromo, onde as células-alvo são marcadas com o isótopo radioativo 51Cr, e o ADCC é quantificado pela medida da radioatividade do sobrenadante das células-alvo lisadas11. Devido aos problemas óbvios devido ao manuseio, armazenamento e descarte estritamente regulamentados de fármacos e resíduos radioativos, esse método tem se tornado cada vez mais popular entre os cientistas da vida. Além disso, também não é passível de aplicativos de alto rendimento. A medição da atividade de enzimas (por exemplo, lactato-desidrogenase) liberadas das células-alvo mortas pode fornecer uma alternativa não radioativa ao ensaio de 51Cr12. Esses ensaios, no entanto, não conseguem distinguir entre mortes celulares alvo e efetora. O Sensor de Impedância Célula-Substrato Elétrico (ECIS) mostrou-se adequado para a quantificação do ADCC13, mas o equipamento ECIS não está disponível na maioria dos laboratórios, e a técnica não é compatível com aplicações/triagem de alto rendimento. Células marcadas fluorescentemente representam uma alternativa popular em muitos ensaios de biologia celular e são frequentemente usadas em citometria de fluxo ou aplicações baseadas em leitores de placas14,15,16. No entanto, esses ensaios geralmente contêm etapas de lavagem ou são incompatíveis com aplicações de alto rendimento (por exemplo, técnicas baseadas em citometria de fluxo). Alguns ensaios populares de citotoxicidade, que teoricamente deveriam ser adequados para a quantificação do ADCC, falham em determinar de forma confiável a eficiência do ADCC13. Recentemente, com a disseminação da microscopia confocal fluorescente, ensaios baseados em imagens e de alto conteúdo estão se tornando cada vez mais populares em várias áreas das ciências da vida17. Por um lado, os equipamentos de imagem celular são agora bastante ubíquos, enquanto, por outro lado, parâmetros morfológicos virtualmente infinitos podem ser coletados a partir das imagens adquiridas. Portanto, nos propusemos a desenvolver um ensaio ADCC compatível com triagem de alto conteúdo e demonstrar sua adequação para triagem de bibliotecas compostas.
Aqui, apresentamos um ensaio ADCC baseado em imagem e demonstramos como este ensaio pode ser usado para triagem de alto conteúdo (HCS) para identificar compostos moduladores do ADCC. O modelo é baseado em células-alvo do carcinoma de mama JIMT-1, células efetoras CD16.176V.NK-92 e trastuzumabe monoclonal anticorpo anti-HER2 humanizado. Com esse método, é possível identificar drogas que possam aumentar a ação tumoral das células NK ou obter informações sobre o mecanismo do ADCC mediado por células NK através da identificação de pequenas moléculas que interferem com o ADCC. Sugerimos que cientistas da vida com o objetivo de quantificar a citotoxicidade mediada por células, com especial atenção ao ADCC, podem se beneficiar do uso deste ensaio tanto para a ciência da descoberta quanto para o desenvolvimento de fármacos. Este ensaio pode ser uma alternativa se um laboratório tiver acesso e alguma experiência em imagem fluorescente e análise quantitativa de imagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
A reação do ADCC tem sido descrita há relativamente muito tempo. Eventos moleculares importantes do processo também foram descritos19. Os métodos de medição do ADCC vão desde o ensaio de liberação radioativa de cromo padrão-ouro, ensaios de liberação enzimática citoplasmática até vários ensaios de citometria de fluxo ou microplacas baseados em fluorescência20. No entanto, uma limitação comum desses ensaios é que eles não são passíveis de aplicativos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV recebeu financiamento do National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS”, GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE e OTKA K132193, K147482. As células CD16.176V.NK-92 foram obtidas do Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, em nome da Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), são protegidos por patentes em todo o mundo, e foram licenciados pela Nantkwest, lnc. Os autores agradecem a György Vereb e Árpád Szöőr por sua ajuda com o uso da linha celular NK-92 e pelo aconselhamento técnico.
Materials
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
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