抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)
Summary
このプロトコルは、治療用抗HER-2抗体の存在下でナチュラルキラー細胞媒介性乳がん細胞死滅を調節する化合物を同定するための自動化された画像ベースのハイスループット技術を提示します。
Abstract
抗原特異的抗体または免疫チェックポイント阻害剤による免疫療法は、乳がんの治療に革命をもたらしました。上皮成長因子受容体HER2を発現する乳癌細胞は、抗HER-2抗体トラスツズマブによって標的とすることができる。抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、HER-2の抗腫瘍作用に関与する重要なメカニズムです。がん細胞に結合したトラスツズマブは、ADCCエフェクター細胞(ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、顆粒球など)のFc受容体によって認識され、これらの免疫細胞の細胞傷害活性を引き起こし、がん細胞死につながります。私たちは、ハイコンテントスクリーニングによって新規ADCCモジュレーター化合物を同定するために、ADCCを定量するための画像ベースのアッセイの開発に着手しました。本アッセイでは、HER2過剰発現JIMT-1乳癌細胞をトラスツズマブ存在下でNK-92細胞と共培養し、自動顕微鏡および定量画像解析により標的細胞死を定量します。標的細胞は、EGFP蛍光に基づいてエフェクター細胞と区別されます。ADCCモジュレーター薬を同定するために、アッセイで化合物ライブラリをテストする方法を示します。この目的のために、ラボの棚からランダムに選択されたファインケミカルを使用して、化合物ライブラリのテストプレートをセットアップしました。NK細胞の移動と脱顆粒を妨げると予想される3つの微小管不安定化化合物(コルヒチン、ビンクリスチン、ポドフィロトキシン)もテストライブラリに含まれていました。テストスクリーニングでは、3つのポジティブコントロール化合物すべてがヒットとして識別され、化学ライブラリ内のADCC修飾薬を同定するための方法の適合性が証明されました。このアッセイでは、化合物ライブラリースクリーニングを実施して、抗がん免疫療法を受けている患者の治療のための補助治療薬として使用できるADCC増強化合物を同定することができます。さらに、この方法は、異なる適応症のために癌患者によって服用された治療薬の望ましくないADCC阻害副作用を特定するためにも使用することができる。
Introduction
抗がん抗体、免疫チェックポイント阻害剤、またはキメラ抗原受容体発現T(CAR-T)細胞による免疫療法は、がん治療への強力なアプローチです1,2,3。トラスツズマブは、HER-2陽性の早期または転移性乳がん、ならびにHER-2陽性の転移性胃がんの治療に使用されるヒト化モノクローナル抗HER-2(ヒト上皮成長因子受容体2)抗体である4,5,6。主に上皮成長因子4の増殖刺激作用を阻害することにより作用する。しかし、トラスツズマブは、がん細胞がHER-2刺激に対する反応性を失っても、効率的にがん細胞死を引き起こすことが報告されています7。抗体のこの逆説的な効果は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)7によるものです。ADCCは、ADCCのエフェクター細胞と総称されるナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、およびマクロファージによって媒介され得る8,9。トラスツズマブなどの抗体が腫瘍細胞に結合する場合、これらのエフェクター細胞はそれらのFc受容体を使用して抗体の定常(Fc)領域に結合します。抗体は、腫瘍細胞とFc受容体担持エフェクター細胞を架橋し、それらの細胞傷害性メディエクター10の放出を誘発する。ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンを含む顆粒の細胞傷害性カーゴを放出して、標的細胞膜とグランザイム(細胞死シグナル伝達経路をトリガーする)に孔を生成し、免疫シナプスに働きかけ、がん細胞のアポトーシスを引き起こします(図1を参照)。
図1:ADCCにおけるエフェクターと標的細胞の相互作用。 エフェクターNK細胞の細胞表面Fcγレセプターは、腫瘍細胞の表面に発現しているHER2分子に特異的な抗HER2トラスツズマブ抗体のFc領域を認識する。したがって、いわゆる免疫学的シナプスが2つの細胞間に確立され、エフェクター細胞の細胞傷害性顆粒の指向性エキソサイトーシスを誘導する。放出されたパーフォリンおよびグランザイム分子は、最終的に標的細胞のアポトーシスをもたらす。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ADCCを含むいくつかのアッセイが細胞毒性を定量化するために以前に開発されている。ゴールドスタンダードは放射性クロム放出法であり、標的細胞を放射性51Cr同位体で標識し、溶解した標的細胞11の上清から放射能を測定することでADCCを定量する。放射性ファーモンおよび廃棄物の取り扱い、保管、および処分が厳しく規制されているため、この方法は生命科学者の間でますます人気がなくなりました。さらに、高スループットのアプリケーションにも適していません。死滅した標的細胞から放出される酵素(例えば、乳酸脱水素酵素)の活性を測定することは、51Crアッセイ12に代わる非放射性代替物を提供することができる。しかし、これらのアッセイでは、標的細胞死とエフェクター細胞死を区別できません。電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)はADCC13の定量に適していることが証明されましたが、ECIS機器はほとんどのラボで利用できず、この手法はハイスループットアプリケーション/スクリーニングと互換性がありません。蛍光標識された細胞は、多くの細胞生物学アッセイで一般的な代替手段であり、フローサイトメトリーまたはプレートリーダーベースのアプリケーションでよく使用されます14、15、16。ただし、これらのアッセイには洗浄ステップが含まれていることが多く、ハイスループットアプリケーション(フローサイトメトリーベースの技術など)とは互換性がありません。理論的にはADCC定量に適しているはずのいくつかの一般的な細胞毒性アッセイは、ADCC効率を確実に決定することができません13。近年、蛍光共焦点顕微鏡の普及に伴い、画像ベースのハイコンテントアッセイがライフサイエンスの様々な分野でますます普及してきている17。一方では、細胞イメージング装置は現在かなりユビキタスですが、他方では、取得した画像から事実上無限の形態学的パラメータを収集することができます。そこで、ハイコンテントスクリーニング対応のADCCアッセイを開発し、化合物ライブラリースクリーニングへの適合性を実証することを目指しました。
ここでは、画像ベースのADCCアッセイを紹介し、このアッセイをハイコンテントスクリーニング(HCS)に使用してADCC調節化合物を同定する方法を示します。このモデルは、JIMT-1乳癌標的細胞、CD16.176V.NK-92エフェクター細胞、およびヒト化モノクローナル抗HER2抗体トラスツズマブに基づいています。この方法により、ADCCを妨害する低分子を同定することで、NK細胞の殺腫瘍作用を増強できる薬剤を同定したり、NK細胞を介したADCCのメカニズムを解明したりすることができます。ADCCに関して細胞媒介性細胞毒性の定量化を目指す生命科学者は、このアッセイを発見科学または医薬品開発のいずれかに使用することで恩恵を受ける可能性があることを示唆しています。このアッセイは、ラボが蛍光イメージングと定量画像分析にアクセスし、ある程度の経験がある場合の代替手段となる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ADCC反応は比較的前に説明されています。プロセスの重要な分子イベントも記載されている19。ADCCを測定するための方法は、ゴールドスタンダードの放射性クロム放出アッセイ、細胞質酵素放出アッセイからいくつかの蛍光ベースのフローサイトメトリーまたはマイクロプレートアッセイにまで及ぶ20。ただし、これらのアッセイの一般的な制限は、ハイス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LVは、国立研究開発イノベーションオフィスの助成金GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS」、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVEおよびOTKA K132193、K147482から資金提供を受けました。CD16.176V.NK-92細胞は、Dr. Kerry S. Campbell(Fox Chase Center, Philapedlphia, Pen, Brink Biologics, lnc.カリフォルニア州サンディエゴ)は、世界中の特許によって保護されており、nantkwest、lncによってライセンスされています。著者らは、NK-92細胞株の使用と技術的助言を提供してくれたGyörgy VerebとÁrpád Szöőrに感謝しています。
Materials
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
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