High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen
Summary
Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.
Abstract
Die Immuntherapie mit antigenspezifischen Antikörpern oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren hat die Therapie von Brustkrebs revolutioniert. Brustkrebszellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 exprimieren, können mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab angegriffen werden. Die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ist ein wichtiger Mechanismus, der an der Antitumorwirkung von HER2 beteiligt ist. Trastuzumab, das an Krebszellen gebunden ist, kann von den Fc-Rezeptoren von ADCC-Effektorzellen (z. B. natürlichen Killerzellen, Makrophagen und Granulozyten) erkannt werden, wodurch die zytotoxische Aktivität dieser Immunzellen ausgelöst wird, die zum Tod von Krebszellen führt. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, einen bildbasierten Assay für die Quantifizierung von ADCC zu entwickeln, um neuartige ADCC-Modulatorverbindungen durch High-Content-Screening zu identifizieren. In dem Assay werden HER2-überexprimierende JIMT-1-Brustkrebszellen mit NK-92-Zellen in Gegenwart von Trastuzumab kokultiviert, und der Zielzelltod wird durch automatisierte Mikroskopie und quantitative Bildanalyse quantifiziert. Zielzellen werden anhand ihrer EGFP-Fluoreszenz von Effektorzellen unterschieden. Wir zeigen, wie Substanzbibliotheken im Assay getestet werden können, um ADCC-Modulatoren zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Compound-Library-Testplatte mit zufällig ausgewählten Feinchemikalien aus dem Laborregal aufgebaut. Drei Mikrotubuli-destabilisierende Verbindungen (Colchicin, Vincristin, Podophyllotoxin), von denen angenommen wird, dass sie die Migration und Degranulation von NK-Zellen stören, wurden ebenfalls in die Testbibliothek aufgenommen. Das Testscreening identifizierte alle drei Positivkontrollverbindungen als Treffer, was die Eignung der Methode zur Identifizierung von ADCC-modifizierenden Medikamenten in einer chemischen Bibliothek belegt. Mit diesem Assay können Substanzbibliotheks-Screenings durchgeführt werden, um ADCC-verstärkende Verbindungen zu identifizieren, die als adjuvante Therapeutika für die Behandlung von Patienten verwendet werden könnten, die Krebsimmuntherapien erhalten. Darüber hinaus können mit der Methode auch unerwünschte ADCC-hemmende Nebenwirkungen von Therapeutika identifiziert werden, die von Krebspatienten für verschiedene Indikationen eingenommen werden.
Introduction
Die Immuntherapie mit Antikrebsantikörpern, Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T (CAR-T)-Zellen stellt einen wirksamen Ansatz zur Krebsbehandlung dar 1,2,3. Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Anti-HER2-Antikörper (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), der zur Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs im Frühstadium oder metastasierendem Brustkrebs sowie HER2-positivem metastasierendem Magenkrebs eingesetzt wird 4,5,6. Es wirkt in erster Linie, indem es die proliferationsstimulierende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors4 hemmt. Es wurde jedoch berichtet, dass Trastuzumab den Tod von Krebszellen effizient auslöst, selbst wenn die Krebszellen nicht mehr auf die HER2-Stimulation ansprechen7. Diese paradoxe Wirkung des Antikörpers ist auf die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zurückzuführen7. ADCC kann durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen vermittelt werden, die zusammen als Effektorzellen von ADCC 8,9 bekannt sind. Bindet ein Antikörper wie Trastuzumab an Tumorzellen, dann binden diese Effektorzellen über ihre Fc-Rezeptoren an die konstante (Fc) Region des Antikörpers. Der Antikörper überbrückt die Tumorzellen und die Fc-Rezeptor-tragenden Effektorzellen und löst die Freisetzung ihrer zytotoxischen Mediatorenaus 10. Natürliche Killerzellen setzen die zytotoxische Fracht ihrer perforinhaltigen Granula frei, um Poren in der Zielzellmembran und Granzym (das Signalwege für den Zelltod auslöst) in die Immunsynapse zu erzeugen, was zur Apoptose der Krebszellen führt (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Effektor- und Zielzellinteraktionen im ADCC. Der Fcγ-Rezeptor der Effektor-NK-Zelle auf der Zelloberfläche erkennt die Fc-Region des Anti-HER2-Trastuzumab-Antikörpers, der spezifisch für das auf der Oberfläche der Tumorzelle exprimierte HER2-Molekül ist. So entsteht zwischen den beiden Zellen die sogenannte immunologische Synapse, die die gerichtete Exozytose zytotoxischer Granula der Effektorzelle induziert. Die freigesetzten Perforin- und Granzym-Moleküle führen schließlich zur Apoptose der Zielzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zur Quantifizierung der Zytotoxizität wurden bereits mehrere Assays entwickelt, darunter ADCC. Der Goldstandard ist die Methode zur Freisetzung von radioaktivem Chrom, bei der die Zielzellen mit radioaktivem 51Cr-Isotop markiert werden und ADCC durch Messung der Radioaktivität aus dem Überstand lysierter Zielzellenquantifiziert wird 11. Aufgrund der offensichtlichen Probleme, die sich aus der streng reglementierten Handhabung, Lagerung und Entsorgung von radioaktiven Pharmakonen und Abfällen ergeben, ist diese Methode unter Biowissenschaftlern zunehmend unbeliebt geworden. Darüber hinaus ist es auch nicht für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet. Die Messung der Aktivität von Enzymen (z. B. Laktat-Dehydrogenase), die aus den abgetöteten Zielzellen freigesetzt werden, kann eine nicht-radioaktive Alternative zum 51-Cr-Assaydarstellen 12. Diese Assays unterscheiden jedoch nicht zwischen Ziel- und Effektorzelltod. Die elektrische Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS) erwies sich als geeignet für die Quantifizierung von ADCC13, aber die ECIS-Geräte sind in den meisten Labors nicht verfügbar, und die Technik ist nicht mit Hochdurchsatzanwendungen/Screening kompatibel. Fluoreszenzmarkierte Zellen stellen eine beliebte Alternative in vielen zellbiologischen Assays dar und werden häufig in der Durchflusszytometrie oder in Plate-Reader-basierten Anwendungen verwendet14,15,16. Diese Assays enthalten jedoch häufig Waschschritte oder sind anderweitig nicht mit Hochdurchsatzanwendungen (z. B. Durchflusszytometrie-basierte Techniken) kompatibel. Einige gängige Zytotoxizitätsassays, die theoretisch für die ADCC-Quantifizierung geeignet sein sollten, sind nicht in der Lage, die ADCC-Effizienz zuverlässig zu bestimmen13. In jüngster Zeit werden mit der Verbreitung der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bildbasierte High-Content-Assays in verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften immer beliebter17. Auf der einen Seite sind Zellbildgebungsgeräte mittlerweile ziemlich allgegenwärtig, auf der anderen Seite lassen sich aus den aufgenommenen Bildern praktisch unendlich viele morphologische Parameter ableiten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, einen High-Content-Screening-kompatiblen ADCC-Assay zu entwickeln und seine Eignung für das Screening von Substanzbibliotheken zu demonstrieren.
Hier stellen wir einen bildbasierten ADCC-Assay vor und zeigen, wie dieser Assay für das High-Content-Screening (HCS) verwendet werden kann, um ADCC-modulierende Verbindungen zu identifizieren. Das Modell basiert auf JIMT-1 Mammakarzinom-Zielzellen, CD16.176V.NK-92 Effektorzellen und dem humanisierten monoklonalen Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab. Mit dieser Methode ist es möglich, Medikamente zu identifizieren, die die tumorabtötende Wirkung von NK-Zellen verstärken können, oder Einblicke in den Mechanismus der NZ-Zell-vermittelten ADCC zu gewinnen, indem kleine Moleküle identifiziert werden, die die ADCC stören. Wir schlagen vor, dass Biowissenschaftler, die die zellvermittelte Zytotoxizität unter besonderer Berücksichtigung von ADCC quantifizieren wollen, von der Verwendung dieses Assays entweder für die Entdeckungswissenschaft oder die Arzneimittelentwicklung profitieren könnten. Dieser Assay kann eine Alternative sein, wenn ein Labor Zugang zu und Erfahrung in der Fluoreszenzbildgebung und quantitativen Bildanalyse hat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ADCC-Reaktion wurde schon vor relativ langer Zeit beschrieben. Wichtige molekulare Ereignisse des Prozesses wurden ebenfalls beschrieben19. Die Methoden zur Messung der ADCC reichen vom Goldstandard für den Assay zur Freisetzung von radioaktivem Chrom über zytoplasmatische Enzymfreisetzungsassays bis hin zu verschiedenen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie- oder Mikrotiterplatten-Assays20. Eine häufige Einschränkung dieser Assays besteht jedoch darin, dass sie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV erhielt Mittel aus den Zuschüssen des Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsamtes GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS”, GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE und OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92-Zellen wurden von Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, im Auftrag von Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sind weltweit durch Patente geschützt und wurden von Nantkwest, lnc, lizenziert. Die Autoren danken György Vereb und Árpád Szöőr für ihre Hilfe bei der Verwendung der NK-92-Zelllinie und für die technische Beratung.
Materials
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
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