Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) dentro da colmeia (enfermeiras e outras abelhas da colmeia) e fora da colmeia (forrageiras) estão expostas a mudanças climáticas e climáticas, vários pesticidas, patógenos e desnutrição, entrando principalmente pela boca e afetando principalmente os tratos digestivos das abelhas adultas. Para entender e prevenir os efeitos de tais estressores externos e internos nas abelhas, um método de pesquisa útil é o método imuno-histoquímico. Um protocolo básico é descrito para preparar o intestino médio (ventrículo) e as glândulas hipofaríngeas (HPGs) de abelhas adultas para análise histológica. Uma metodologia detalhada é descrita para avaliar o nível de dano celular e distinguir necrose de morte celular programada (apoptose) como um processo natural de regeneração tecidual. Os resultados do tratamento de abelhas adultas com ácido oxálico e pesticidas (inseticida e acaricida) e a determinação da morte celular no ventrículo e HPGs são apresentados. Os prós e contras da metodologia também são discutidos.
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são, entre outros polinizadores silvestres, os mais importantes polinizadores das plantas agrícolas. Ao longo de milhares de anos, o ambiente em mudança influenciou as abelhas a adaptar sua morfologia, fisiologia, comportamento e tolerância a vários patógenos e parasitas. Portanto, as abelhas desenvolveram uma gama altamente diversificada de espécies e subespécies em todo o mundo1. Esses resultados são consistentes com achados anteriores, de que há variação genética na estrutura do trato digestivo da abelha, mas também sugerem que as alterações do intestino médio são devidas a fatores ambientais 2,3.
O trato digestivo da abelha tem três partes principais: intestino anterior, intestino médio (ventrículo) e intestino posterior4. O ventrículo é um órgão essencial para a digestão do pólen e néctar/mel; no intestino posterior, o controle osmótico ocorre por meio da absorção de água e íons2. As glândulas hipofaríngeas (HPGs) das operárias das abelhas estão localizadas na cabeça e sintetizam e secretam componentes de geleia real para alimentar a ninhada, a rainha e os membros da colônia. Seu tamanho muda com a idade e as tarefas e depende de uma nutrição adequada (pólen de qualidade). Enfermeiros trabalhadores com idade entre 6 e 18 dias realizam a criação de ninhadas, e o tamanho dos HPGs aumenta 5,6. Nas abelhas forrageiras, os HPGs degeneram e apenas secretam enzimas importantes para converter os açúcares complexos em açúcares simples (α-glucosidases, leucina arilamidase, invertase) no mel7.
As abelhas são expostas a vários estressores bióticos e abióticos8, e o trato digestivo pode ser afetado por vários estimulantes negativos. A primeira barreira que protege o organismo de patógenos é a membrana peritrófica no intestino médio, que consiste na mucosa intestinal para proteção contra patógenos4. O desenvolvimento e a função dos HPGs dependem da dieta, da idade e da condição dacolônia9, e são afetados por inseticidas, acaricidas 10 e patógenos11,12,13. Os resíduos de acaricidas na colmeia devido ao tratamento de controle de varroa e os agrotóxicos do ambiente afetam abelhas forrageiras e abelhas enfermeiras14,15. A maior ameaça às colônias de abelhas é o ácaro Varroa destructor, tanto como vetor de vírus que contribuem para a perda de colônias16 quanto como consumidor do corpo gordo do hospedeiro (importante órgão vital nas abelhas), o que, consequentemente, afeta o corpo do indivíduo e as funções da colônia17.
No entanto, habitats intensivos de terras agrícolas podem fornecer um suprimento de alimentos a curto prazo para as abelhas. Por conseguinte, os regimes agro-ambientais devem aumentar a disponibilidade de flores de mel nas paisagens agrícolas18. Para avaliar a morfologia de diferentes subespécies 6,19,20,21 ou os efeitos subletais desses fatores nos níveis celular ou tecidual, especialmente intestino médio e HPGs, métodos histológicos e imuno-histoquímicos são práticos e suficientemente precisos para serem utilizados em pesquisas histológicas em abelhas.
Em organismos vivos, a morte celular é definida como apoptose ou necrose25 e pode ser acompanhada de autofagia26. A diferença entre células apoptóticas e necróticas é que a apoptose é uma forma de morte celular programada e aparece em células normais, enquanto a necrose ocorre devido a condições letais (por exemplo, acidente, doença)27,28. A apoptose pode ser detectada usando kits de ensaio baseados na t?…
The authors have nothing to disclose.
Agradeço o apoio da Agência Eslovena de Investigação, subvenção n.º P4-133.
2-Propanol | |||
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
Covers | |||
DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
Distilled water | |||
Embedding cassette | |||
EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
Flattening table | Leica | HI1220 | |
Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
Formalin 10% | Formaldehyde | ||
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
Hydrogen peroxidase 3% | |||
Incubator | BioRad | ||
Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
KH2PO4 | |||
Lab clock | |||
Light microscope | Leica | ||
Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
Microtome | Leica | ||
Modular tissue embedding station | Leica | ||
Na2HPO4 | |||
NaCl | |||
Paraformaldehyde 4% | |||
Paraplast | Leica | ||
Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
PBS | |||
Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
Proteinase K | Merck | 21627 | |
Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
Water bath | Leica | ||
Watercolor brush | 2x | ||
Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |