שיטות אימונוהיסטוכימיות שימושיות במחקר דבורת הדבש כדי לזהות ולהעריך את רמת האפופטוזיס והנמק בבלוטות האמצע והלוע של דבורים בוגרות.
דבורי הדבש (Apis mellifera L.) בתוך הכוורת (אחיות ודבורי כוורת אחרות) ומחוץ לכוורת (foragers) חשופות לשינויי אקלים ומזג אוויר, חומרי הדברה שונים, פתוגנים ותת תזונה, הנכנסים בעיקר דרך הפה ומשפיעים בעיקר על דרכי העיכול של דבורים בוגרות. כדי להבין ולמנוע את ההשפעות של גורמי לחץ חיצוניים ופנימיים כאלה על דבורי הדבש, אחת משיטות המחקר השימושיות היא השיטה האימונוהיסטוכימית. פרוטוקול בסיסי מתואר להכנת בלוטות האמצע (ventriculus) וההיפו-לוע (HPGs) של דבורים בוגרות לניתוח היסטולוגי. מתודולוגיה מפורטת מתוארת כדי להעריך את רמת הנזק לתאים ולהבחין בין נמק למוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס) כתהליך טבעי של התחדשות רקמות. תוצאות הטיפול בדבורת הדבש הבוגרת בחומצה אוקסלית ובחומרי הדברה (קוטל חרקים ואקריציד) וקביעת מוות תאי בחדר וב- HPGs מוצגות. היתרונות והחסרונות של המתודולוגיה נדונים גם הם.
דבורי הדבש (Apis mellifera L.) הן, בין שאר מאביקות הבר, המאביקות החשובות ביותר של צמחים חקלאיים. במשך אלפי שנים, הסביבה המשתנה השפיעה על הדבורים להתאים את המורפולוגיה, הפיזיולוגיה, ההתנהגות והעמידות שלהן למספר פתוגנים וטפילים. לכן, דבורי הדבש פיתחו מגוון רחב מאוד של מינים ותת-מינים ברחבי העולם1. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם ממצאים קודמים, שלפיהם קיימת שונות גנטית במבנה מערכת העיכול של דבורת הדבש, אך גם מצביעות על כך ששינויים במידגוט נובעים מגורמים סביבתיים 2,3.
מערכת העיכול של דבורת הדבש כוללת שלושה חלקים עיקריים: פורגוט, מידגוט (ventriculus) והינדגוט4. החדר הוא איבר חיוני לעיכול אבקה וצוף/דבש; ב hindgut, שליטה אוסמוטית מתרחשת באמצעות ספיגת מים ויונים2. בלוטות ההיפו-לוע (HPGs) של עובדי דבורת הדבש ממוקמות בראש ומסנתזות ומפרישות רכיבי מזון מלכות כדי להאכיל את הברוד, את המלכה ואת חברי המושבה. גודלם משתנה עם הגיל והמשימות ותלוי בתזונה נכונה (אבקה איכותית). עובדי אחיות בגילאי 6 עד 18 ימים מבצעים גידול גזעים, וגודל ה- HPGs גדלב- 5,6. בדבורים, ה-HPGs מתנוונים ומפרישים רק אנזימים החשובים להמרת הסוכרים המורכבים לפשוטים (α-גלוקוזידאזות, לאוצין ארילאמידאז, אינברטאז) בדבש7.
דבורי הדבש נחשפות למספר גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים8, ומערכת העיכול עלולה להיות מושפעת ממספר ממריצים שליליים. המחסום הראשון המגן על האורגניזם מפני פתוגנים הוא הממברנה הפריטרופית ב midgut, אשר מורכב רירית המעי כדי להגן מפני פתוגנים4. ההתפתחות והתפקוד של HPGs תלויים בתזונה, בגיל ובמצב המושבה9, והם מושפעים מקוטלי חרקים, אקריצידים 10 ופתוגנים11,12,13. שאריות של קוטל בקראיים בכוורת עקב טיפול בהדברת וורואה וחומרי הדברה מהסביבה משפיעים על דבורי מספוא ודבורים אחיות14,15. האיום הגדול ביותר על מושבות דבורי הדבש הוא משמיד הקרדית Varroa, הן כווקטור של וירוסים התורמים לאובדן מושבות16 והן כצרכן של גוף השומן של המארח (איבר חיוני חשוב בדבורי הדבש), וכתוצאה מכך משפיע על גופו של הפרט ועל תפקודי המושבה17.
עם זאת, בתי גידול חקלאיים אינטנסיביים יכולים לספק אספקת מזון לטווח קצר לדבורי הדבש. לכן, תוכניות חקלאיות-סביבתיות צריכות לשפר את הזמינות של פרחי דבש בנופים חקלאיים18. כדי להעריך את המורפולוגיה של תת-מינים שונים 6,19,20,21 או השפעות תת-קטלניות של גורמים אלה ברמת התא או הרקמה, במיוחד midgut ו- HPGs, שיטות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות הן מעשיות ומדויקות מספיק כדי לשמש במחקר היסטולוגיה בדבורי דבש.
באורגניזמים חיים, מוות תאי מוגדר כאפופטוזיס או נמק25 ויכול להיות מלווה באוטופגיה26. ההבדל בין תאים אפופטוטיים לנמקיים הוא שאפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת ומופיע בתאים רגילים, בעוד נמק מתרחש עקב תנאים קטלניים (למשל, תאונה, מחלה)27,28<…
The authors have nothing to disclose.
אני מודה על תמיכת סוכנות המחקר הסלובנית, מענק מס ‘P4-133.
2-Propanol | |||
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
Covers | |||
DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
Distilled water | |||
Embedding cassette | |||
EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
Flattening table | Leica | HI1220 | |
Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
Formalin 10% | Formaldehyde | ||
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
Hydrogen peroxidase 3% | |||
Incubator | BioRad | ||
Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
KH2PO4 | |||
Lab clock | |||
Light microscope | Leica | ||
Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
Microtome | Leica | ||
Modular tissue embedding station | Leica | ||
Na2HPO4 | |||
NaCl | |||
Paraformaldehyde 4% | |||
Paraplast | Leica | ||
Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
PBS | |||
Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
Proteinase K | Merck | 21627 | |
Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
Water bath | Leica | ||
Watercolor brush | 2x | ||
Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |