免疫组织化学方法可用于蜜蜂研究,以检测和评估成年蜜蜂中肠和下咽腺的细胞凋亡和坏死水平。
蜂巢内(护士和其他蜂巢蜜蜂)和蜂巢外(觅食者)的蜜蜂(Apis mellifera L.)暴露于气候和天气变化,各种杀虫剂,病原体和营养不良,主要通过口腔进入,主要影响成年蜜蜂的消化道。为了了解和防止这种外部和内部压力源对蜜蜂的影响,一种有用的研究方法是免疫组织化学方法。描述了准备成年蜜蜂的中肠(脑室)和下咽腺(HPG)以进行组织学分析的基本方案。描述了一种详细的方法来评估细胞损伤水平,并将坏死与作为组织再生自然过程的程序性细胞死亡(细胞凋亡)区分开来。介绍了用草酸和杀虫剂(杀虫剂和杀螨剂)处理成年蜜蜂的结果以及脑室和HPG中细胞死亡的测定。还讨论了该方法的优缺点。
蜜蜂(Apis mellifera L.)是其他野生传粉媒介,也是农业植物最重要的传粉媒介。几千年来,不断变化的环境影响了蜜蜂调整其形态、生理、行为和对几种病原体和寄生虫的耐受性。因此,蜜蜂在全球范围内发展出高度多样化的物种和亚种1。这些结果与先前的发现一致,即蜜蜂的消化道结构存在遗传变异,但也表明中肠的改变是由于环境因素2,3。
蜜蜂的消化道有三个主要部分:前肠、中肠(脑室)和后肠4。脑室是消化花粉和花蜜/蜂蜜的重要器官;在后肠中,渗透控制是通过吸收水和离子2进行的。蜜蜂工人的下咽腺(HPG)位于头部,合成和分泌蜂王浆成分,以喂养育雏,蜂王和蜂群成员。它们的大小随着年龄和任务而变化,并取决于适当的营养(优质花粉)。6至18天的护士进行育雏,HPG的大小增加5,6。在觅食蜂中,HPGs退化并仅分泌对将蜂蜜中的复杂糖转化为简单糖(α-葡萄糖苷酶,亮氨酸芳基酰胺酶,转化酶)很重要的酶7。
蜜蜂暴露于几种生物和非生物应激源8,消化道可能受到几种负面兴奋剂的影响。保护生物体免受病原体侵害的第一道屏障是中肠的周养膜,它由肠粘膜组成,以防止病原体4。HPG 的发育和功能取决于饮食、年龄和菌落条件9,并受到杀虫剂、杀螨剂10 和病原体11、12、13 的影响。由于瓦罗亚控制处理和来自环境的杀虫剂,蜂巢中的杀螨剂残留会影响觅食蜂和护士蜂14,15。对蜜蜂群体的最大威胁是螨虫Varroa破坏者,既是导致蜂群损失的病毒载体16,也是宿主肥胖身体(蜜蜂的重要重要器官)的消费者,因此会影响个体的身体和群体功能17。
然而,集约化的农田栖息地可以为蜜蜂提供短期的食物供应。因此,农业环境计划应提高农业景观中蜜花的供应18.为了评估不同亚种6,19,20,21的形态或这些因素在细胞或组织水平上的亚致死作用,特别是中肠和HPG,组织学和免疫组织化学方法是实用的,并且足够准确,可用于蜜蜂的组织学研究。
在生物体中,细胞死亡被定义为细胞凋亡或坏死25,并可伴有自噬26。凋亡细胞和坏死细胞之间的区别在于,细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式,出现在正常细胞中,而坏死是由于致命条件(例如,事故,疾病)而发生的27,28。可以使用基于TUNEL技术的检测试剂盒检测细胞凋亡(通过在细胞凋亡过程中产生的双链D…
The authors have nothing to disclose.
我非常感谢斯洛文尼亚研究机构的支持,批准号P4-133。
2-Propanol | |||
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
Covers | |||
DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
Distilled water | |||
Embedding cassette | |||
EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
Flattening table | Leica | HI1220 | |
Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
Formalin 10% | Formaldehyde | ||
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
Hydrogen peroxidase 3% | |||
Incubator | BioRad | ||
Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
KH2PO4 | |||
Lab clock | |||
Light microscope | Leica | ||
Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
Microtome | Leica | ||
Modular tissue embedding station | Leica | ||
Na2HPO4 | |||
NaCl | |||
Paraformaldehyde 4% | |||
Paraplast | Leica | ||
Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
PBS | |||
Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
Proteinase K | Merck | 21627 | |
Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
Water bath | Leica | ||
Watercolor brush | 2x | ||
Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |