Здесь представлен протокол радиоактивного мечения клеток радиоизотопом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 89 Zr (t1/2 78,4 ч) с использованием готового к использованию синтона радиомечения, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([89Zr]Zr-DBN). Радиоактивное мечение клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN позволяет неинвазивно отслеживать и визуализировать введенные радиоактивно меченные клетки в организме с помощью ПЭТ в течение 7 дней после введения.
Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) становится перспективной терапией для регенерации органов и иммунотерапии различных видов рака. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в этих областях, еще многое предстоит узнать, чтобы лучше понять фармакокинетику и фармакодинамику вводимых терапевтических клеток в живой системе. Для неинвазивного отслеживания клеток in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) был разработан новый [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([89 Zr]Zr-DBN)-опосредованный метод радиомечения клеток с использованием 89Zr (t1/2 78,4 ч). В настоящем протоколе описан [89Zr]Zr-DBN-опосредованный, готовый к использованию, радиомечущий синтон для прямого радиоактивного мечения различных клеток, включая мезенхимальные стволовые клетки, кардиопоэтические стволовые клетки, управляемые линией, регенерирующие гепатоциты печени, лейкоциты, клетки меланомы и дендритные клетки. Разработанная методика позволяет проводить неинвазивную ПЭТ-визуализацию клеточного транспорта в течение 7 дней после введения, не влияя на природу или функцию радиоактивно меченных клеток. Кроме того, в этом протоколе описывается поэтапный метод радиосинтеза [89 Zr]Zr-DBN, биосовместимая формулировка [89 Zr]Zr-DBN, подготовка клеток к радиоактивному мечению и, наконец, радиомечение клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN, включая все сложные детали, необходимые для успешного радиомечения клеток.
Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) набирает популярность и активно исследуется для лечения различных заболеваний, таких как недостаточность миокарда1,2, дегенерация сетчатки 2, дегенерация желтого пятна 2, диабет 2, инфаркт миокарда 3,4,5 и рак 6,7,8,9,10. Среди двух вероятных подходов терапии стволовыми клетками стволовые клетки могут быть либо непосредственно приживлены к очагу заболевания, чтобы вызвать терапевтический ответ, либо вызвать изменения в микроокружении очага заболевания без прилипания к очагу заболевания, чтобы инициировать непрямой терапевтический ответ. Непрямой терапевтический ответ может вызвать изменения в микроокружении очага заболевания путем высвобождения факторов, которые могут восстанавливать или лечить заболевание5. Эти подходы к лечению стволовыми клетками могут быть оценены с помощью неинвазивной визуализации радиомеченных стволовых клеток. Неинвазивная визуализация может соотнести поглощение радиоактивно меченных клеток в очаге заболевания с терапевтическим ответом, чтобы расшифровать прямой и непрямой терапевтический ответ.
Кроме того, для лечения различных видов рака разрабатывается терапия на основе иммунных клеток с использованием CAR-T-клеток 6,7,8,9,10 и иммунотерапии дендритными клетками 11,12. Механистически при CAR-Т-клеточной иммунотерапии 6,7,8,9,10 Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать эпитоп, который связывается со специфическим антигеном на опухолях, которые необходимо лечить. Эти сконструированные CAR-Т-клетки при введении связываются со специфическим антигеном, присутствующим в опухолевых клетках, посредством взаимодействия эпитоп-антиген. После связывания связанные CAR-Т-клетки подвергаются активации, а затем пролиферируют и высвобождают цитокины, которые сигнализируют иммунной системе хозяина атаковать опухоль, экспрессирующую специфический антиген. В отличие от этого, в случае терапии дендритными клетками11,12 дендритные клетки сконструированы таким образом, чтобы представлять на своей поверхности специфический раковый антиген. Эти сконструированные дендритные клетки при введении оседают в лимфатических узлах и связываются с Т-клетками в лимфатических узлах. Т-клетки, связываясь со специфическими раковыми антигенами на введенных дендритных клетках, подвергаются активации/пролиферации и инициируют иммунный ответ хозяина против опухоли, экспрессирующей этот специфический антиген. Таким образом, оценка транспорта введенных CAR-Т-клеток к опухолевому очагу9,10 и хоминг дендритных клеток к лимфатическим узлам11,12 возможна с помощью визуализации радиоактивно меченных CAR T-клеток и дендритных клеток для определения эффективности иммунотерапии. Кроме того, неинвазивный транспорт клеток может помочь лучше понять терапевтический потенциал, прояснить прямой и непрямой терапевтический ответ, а также прогнозировать и контролировать терапевтический ответ как на терапию стволовыми клетками, так и на основе иммунных клеток.
Были изучены различные методы визуализации для транспортировки клеток 3,4,9,10,12, включая оптическую визуализацию, магнитно-резонансную томографию (МРТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). Каждая из этих методик имеет свои преимущества и недостатки. Среди них ПЭТ является наиболее перспективным методом благодаря своей количественной природе и высокой чувствительности, которые необходимы для надежного количественного определения клеток при транспортировке клеток на основе визуализации 3,4,9,10.
Позитронно-излучающий радиоизотоп 89Zr с периодом полураспада 78,4 ч пригоден для мечения клеток. Он позволяет проводить ПЭТ-визуализацию клеток в течение более 1 недели и легко производится с помощью широко доступных низкоэнергетических медицинских циклотронов 13,14,15,16,17. Кроме того, коммерчески доступен соответствующим образом функционализированный хелатор-изотиоцианатобензилдесфериоксамина (DFO-Bn-NCS) для синтеза 89-Zr-меченного, готового к использованию синтона, мечущего клетки, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-деферриоксамин, также известного как [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24 ,25. Принцип [89 Zr]Zr-DBN-опосредованного мечения клеток основан на реакции между первичными аминами белков клеточной мембраны и изотиоцианатным (NCS) фрагментом [89Zr]Zr-DBN с образованием стабильной ковалентной тиомочевинной связи.
[89зр] Для отслеживания различных клеток, включая стволовые клетки 18,23,25, дендритные клетки18, кардиопоэтические стволовые клетки19, децидуальные стромальные клетки 20, макрофаги костного мозга 20, мононуклеарные клетки периферической крови 20, Т-клетки21, гепатоциты22,24 и лейкоциты 25. В следующем протоколе представлены пошаговые методы подготовки и радиоактивного мечения клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN и описаны изменения, которые могут потребоваться в протоколе радиомечения для конкретного типа клеток. Для большей наглядности представленный здесь метод радиомечения клеток разделен на четыре раздела. Первый раздел посвящен получению [89 Zr]Zr-DBN путем хелатирования 89Zr с DFO-Bn-NCS. Во втором разделе описывается приготовление биосовместимой формулы [89Zr]Zr-DBN, которая может быть легко использована для мечения клеток радиотерапией. В третьем разделе описываются этапы, необходимые для предварительной подготовки клеток к радиоактивному мечению. Предварительное кондиционирование клеток включает в себя промывание клеток безбелковым фосфатно-солевым буфером (PBS) и сбалансированным солевым раствором HEPES (H-HBSS) для удаления внешних белков, которые могут мешать или конкурировать с реакцией [89Zr]Zr-DBN с первичными аминами, присутствующими на белках клеточной поверхности во время радиоактивного мечения. В заключительном разделе описаны этапы, связанные с фактическим радиоактивным мечением клеток и анализом контроля качества.
Ниже приведены важнейшие этапы протокола, которые необходимо оптимизировать для эффективного клеточного радиомечения. На этапах протокола 1.2 и 1.3, в зависимости от используемого объема [89 Zr]Zr(HPO 4)2 или [89Zr]ZrCl4, необходимо использовать соответствующий объем (микрол?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 и DOE DE-SC0008947, Международным агентством по атомной энергии, Вена, Отделением ядерной медицины клиники Майо, отделением радиологии, и Центром регенеративной медицины клиники Майо, Рочестер, Миннесота. Все фигуры были созданы с использованием BioRender.com.
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |