細胞輸送の陽電子放出断層撮影イメージング:細胞放射性標識法
Summary
ここに示されるすぐに使用できるradiolabelingシントンを使用して陽電子放出断層撮影(ペット)の放射性同位体、 89Zr (t1/2 78.4 h)の放射性分類のセルにプロトコルはある、[89Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr] Zr-DBN)。[89Zr]Zr-DBNを用いた放射性標識細胞は、投与後最大7日間、PETで体内に投与された放射性標識細胞の非侵襲的な追跡とイメージングを可能にします。
Abstract
幹細胞およびキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、臓器再生の有望な治療法として、またさまざまながんの免疫療法として浮上しています。これらの分野では大きな進歩が見られましたが、生体系で投与された治療細胞の薬物動態と薬力学をよりよく理解するためには、さらに多くのことを学ぶ必要があります。陽電子放射断層撮影法(PET)による細胞の非侵襲的in vivo追跡のために、89 Zr(t1/2 78.4 h)を利用して、新しい[89Zr]Zr-p-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン([89Zr]Zr-DBN)を介した細胞放射性標識法が開発されました。現在のプロトコルは間葉系幹細胞、血統導かれた心poietic幹細胞、肝細胞、白血球、メラノーマの細胞および樹状細胞を再生するレバーを含むいろいろなセルの直接radiolabelingのための[89Zr] ZrDBN仲介された、すぐに使用できる、radiolabelingシントンを記述する。開発された方法論は、放射性標識細胞の性質や機能に影響を与えることなく、投与後最大7日間、細胞輸送の非侵襲的PETイメージングを可能にします。さらに、このプロトコルは[89Zr] Zr-DBN、[89 Zr] Zr-DBNのbiocompatible公式、radiolabelingのためのセルの準備、および最終的にセルの巧妙なradiolabelingに必要なすべての複雑な細部を含む[89Zr] ZrDBNのセルのradiolabelingのための段階的な方法を、記述する。
Introduction
幹細胞およびキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は人気が高まっており、心筋不全1,2、網膜変性2、黄斑変性2、糖尿病2、心筋梗塞3,4,5、癌6,7,8,9などのさまざまな疾患の治療のために活発に研究されています。10.幹細胞療法の2つの妥当なアプローチのうち、幹細胞は疾患部位に直接生着して治療反応を引き起こすか、疾患部位に付着せずに疾患部位の微小環境に変化を引き起こして間接的な治療反応を開始することができます。間接的な治療反応は、疾患を修復または治療する因子を放出することにより、疾患部位の微小環境の変化を引き起こす可能性があります5。幹細胞治療のこれらのアプローチは、放射性標識幹細胞の非侵襲的イメージングによって評価できます。非侵襲的イメージングは、疾患部位上の放射性標識細胞の取り込みを治療反応と相関させて、直接的および間接的な治療的反応を解読することができます。
さらに、CAR-T細胞6,7,8,9,10および樹状細胞免疫療法11,12を使用して、さまざまな癌を治療するための免疫細胞ベースの治療法が開発されています。機構的には、CAR-T細胞免疫療法6,7,8,9,10では、T細胞は、治療が必要な腫瘍上の特定の抗原に結合するエピトープを発現するように操作されます。これらの改変されたCAR-T細胞は、投与されると、エピトープ-抗原相互作用を介して腫瘍細胞上に存在する特異的抗原に結合します。結合後、結合したCAR-T細胞は活性化を受け、増殖してサイトカインを放出し、宿主の免疫系に特定の抗原を発現する腫瘍を攻撃するように信号を送ります。対照的に、樹状細胞療法11,12の場合、樹状細胞は、その表面に特異的な癌抗原を提示するように操作される。これらの操作された樹状細胞は、投与されると、リンパ節に宿り、リンパ節のT細胞に結合します。T細胞は、投与された樹状細胞上の特定のがん抗原に結合すると、活性化/増殖を受け、その特定の抗原を発現する腫瘍に対する宿主の免疫応答を開始します。したがって、投与されたCAR-T細胞の腫瘍部位への輸送9,10およびリンパ節11,12への樹状細胞のホーミングの評価は、免疫療法の有効性を決定するために放射性標識CAR-T細胞および樹状細胞をイメージングすることによって可能である。さらに、非侵襲的細胞輸送は、治療の可能性をよりよく理解し、直接的および間接的な治療反応を明確にし、幹細胞および免疫細胞ベースの治療の両方の治療反応を予測および監視するのに役立ちます。
細胞輸送のためのさまざまなイメージングモダリティが検討されています3,4,9,10,12、これには、光イメージング、磁気共鳴画像法(MRI)、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)が含まれます。これらの手法には、それぞれ長所と短所があります。これらの中でも、PETは、その定量性と高感度により、最も有望なモダリティであり、イメージングベースの細胞輸送における細胞の信頼性の高い定量に不可欠です3,4,9,10。
半減期が78.4時間の陽電子放出放射性同位体89Zrは、細胞標識に適しています。1週間以上の細胞輸送のPETイメージングが可能で、広く入手可能な低エネルギー医療用サイクロトロン13,14,15,16,17で容易に製造できます。さらに、適切に官能基化されたp-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン(DFO-Bn-NCS)キレート剤は、89 Zr標識、すぐに使用できる、細胞標識シントン、[89Zr]Zr-p-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン([89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24としても知られる)の合成のために市販されている、25。[89 Zr]Zr-DBNを介した細胞標識の原理は、細胞膜タンパク質の第一級アミンと[89Zr]Zr-DBNのイソチオシアネート(NCS)部分との反応に基づいており、安定な共有結合チオ尿素結合を生成します。
[89ZR]幹細胞18,23,25、樹状細胞18、心形成幹細胞19、脱落間質細胞20、骨髄由来マクロファージ20、末梢血単核細胞20、Jurkat/CAR-T細胞21、肝細胞22,24、白血球25など、さまざまな細胞を追跡するために、Zr-DBNベースの細胞標識とイメージングが発表されています.次のプロトコルは[89Zr] Zr-DBNの調製そしてセルradiolabelingのステップバイステップ方法を提供し、特定のセルタイプのためのradiolabelingプロトコルで要求されるかもしれない変更を記述する。より明確にするために、ここで紹介する細胞放射性標識の方法は4つのセクションに分かれています。最初のセクションでは、DFO-Bn-NCSで89 Zrをキレート化することにより、[89Zr]Zr-DBNを調製します。第2章では、細胞放射性標識に容易に使用できる[89Zr]Zr-DBNの生体適合性製剤の調製について説明します。第3章では、放射性標識のための細胞のプレコンディショニングに必要なステップについて説明します。細胞のプレコンディショニングには、タンパク質を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびHEPES緩衝ハンクス平衡塩溶液(H-HBSS)で細胞を洗浄し、放射性標識中に細胞表面タンパク質に存在する第一級アミンと[89Zr]Zr-DBNの反応を妨害または競合する可能性のある外部タンパク質を除去することが含まれます。最後のセクションでは、細胞の実際の放射性標識と品質管理分析に関連するステップについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
以下は、効果的な細胞放射性標識のために最適化が必要なプロトコルの重要なステップです。プロトコルステップ 1.2 および 1.3 では、使用する [89 Zr]Zr(HPO 4)2 または [89Zr]ZrCl4 の容量に応じて、適切な容量 (マイクロリットル) の塩基を使用する必要があります。1.0 M K 2 CO 3溶液を[89Zr]Zr(HPO 4)2の中和に使用し、[1.0 M Na 2CO 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664、およびDOE DE-SC0008947助成金、国際原子力機関(ウィーン)、メイヨークリニック核医学部門、放射線科、およびメイヨークリニック再生医療センター(ミネソタ州ロチェスター)の支援を受けました。すべてのフィギュアは BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
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