Qui viene presentato un protocollo per radiomarcare le cellule con un radioisotopo per tomografia a emissione di positroni (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), utilizzando un sintetizzatore radiomarcante pronto all’uso, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina ([89Zr]Zr-DBN). La radiomarcatura delle cellule con [89Zr]Zr-DBN consente il monitoraggio e l’imaging non invasivi delle cellule radiomarcate somministrate nell’organismo con PET fino a 7 giorni dopo la somministrazione.
Le terapie con cellule T con cellule staminali e recettori chimerici dell’antigene (CAR) stanno emergendo come terapie promettenti per la rigenerazione degli organi e come immunoterapia per vari tipi di cancro. Nonostante siano stati compiuti progressi significativi in queste aree, c’è ancora molto da imparare per comprendere meglio la farmacocinetica e la farmacodinamica delle cellule terapeutiche somministrate nel sistema vivente. Per il monitoraggio non invasivo e in vivo delle cellule con tomografia a emissione di positroni (PET), è stato sviluppato un nuovo metodo di radiomarcatura cellulare mediato da [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina ([89 Zr]Zr-DBN) utilizzando 89Zr (t1/2 78,4 h). Il presente protocollo descrive un synthon radiomarcato [89Zr]Zr-DBN-mediato, pronto all’uso, per la radiomarcatura diretta di una varietà di cellule, tra cui cellule staminali mesenchimali, cellule staminali cardiopoietiche guidate dal lignaggio, epatociti rigeneranti del fegato, globuli bianchi, cellule di melanoma e cellule dendritiche. La metodologia sviluppata consente l’imaging PET non invasivo del traffico cellulare fino a 7 giorni dopo la somministrazione senza influenzare la natura o la funzione delle cellule radiomarcate. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo graduale per la radiosintesi di [89 Zr]Zr-DBN, la formulazione biocompatibile di [89 Zr]Zr-DBN, la preparazione delle cellule per la radiomarcatura e infine la radiomarcatura delle cellule con [89Zr]Zr-DBN, compresi tutti i dettagli intricati necessari per il successo della radiomarcatura delle cellule.
Le terapie a base di cellule T con cellule staminali e recettori chimerici dell’antigene (CAR) stanno guadagnando popolarità e sono in fase di studio attivo per il trattamento di varie malattie, come l’insufficienza miocardica1,2, la degenerazione retinica 2, la degenerazione maculare 2, il diabete 2, l’infarto del miocardio 3,4,5 e i tumori 6,7,8,9.10. Tra i due approcci plausibili delle terapie con cellule staminali, le cellule staminali possono essere innestate direttamente sul sito della malattia per causare una risposta terapeutica o causare cambiamenti nel microambiente del sito della malattia senza aderire al sito della malattia per avviare una risposta terapeutica indiretta. Una risposta terapeutica indiretta potrebbe causare cambiamenti nel microambiente della sede della malattia rilasciando fattori che potrebbero riparare o trattare la malattia5. Questi approcci di terapie con cellule staminali potrebbero essere valutati mediante imaging non invasivo di cellule staminali radiomarcate. L’imaging non invasivo potrebbe correlare l’assorbimento delle cellule radiomarcate nel sito della malattia con una risposta terapeutica per decifrare la risposta terapeutica diretta rispetto a quella indiretta.
Inoltre, sono in fase di sviluppo terapie basate sulle cellule immunitarie per il trattamento di vari tumori utilizzando le cellule T CAR 6,7,8,9,10 e l’immunoterapia con cellule dendritiche 11,12. Meccanicisticamente, nell’immunoterapia con cellule T CAR 6,7,8,9,10, le cellule T sono ingegnerizzate per esprimere un epitopo che si lega a un antigene specifico sui tumori che deve essere trattato. Queste cellule CAR-T ingegnerizzate, al momento della somministrazione, si legano all’antigene specifico presente sulle cellule tumorali attraverso un’interazione epitopo-antigene. Dopo il legame, le cellule CAR-T legate subiscono l’attivazione e quindi proliferano e rilasciano citochine, che segnalano al sistema immunitario dell’ospite di attaccare il tumore che esprime l’antigene specifico. Al contrario, nel caso delle terapie con cellule dendritiche11,12, le cellule dendritiche sono ingegnerizzate per presentare uno specifico antigene tumorale sulla loro superficie. Queste cellule dendritiche ingegnerizzate, quando somministrate, ospitano i linfonodi e si legano alle cellule T nei linfonodi. Le cellule T, legandosi agli antigeni tumorali specifici sulle cellule dendritiche somministrate, subiscono attivazione/proliferazione e avviano una risposta immunitaria dell’ospite contro il tumore che esprime quell’antigene specifico. Quindi, la valutazione del traffico di cellule CAR-T somministrate a un sito tumorale9,10 e l’homing delle cellule dendritiche ai linfonodi11,12 è possibile mediante imaging di cellule CAR-T radiomarcate e cellule dendritiche per determinare l’efficacia dell’immunoterapia. Inoltre, il traffico cellulare non invasivo può aiutare a comprendere meglio il potenziale terapeutico, chiarire la risposta terapeutica diretta rispetto a quella indiretta e prevedere e monitorare la risposta terapeutica delle terapie a base di cellule staminali e immunitarie.
Sono state esplorate diverse modalità di imaging per il traffico cellulare 3,4,9,10,12, tra cui l’imaging ottico, la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT) e la tomografia a emissione di positroni (PET). Ognuna di queste tecniche ha i suoi vantaggi e svantaggi. Tra queste, la PET è la modalità più promettente grazie alla sua natura quantitativa e all’elevata sensibilità, che sono essenziali per la quantificazione affidabile delle cellule nel traffico cellularebasato sull’imaging 3,4,9,10.
Il radioisotopo che emette positroni 89Zr, con un’emivita di 78,4 ore, è adatto per la marcatura cellulare. Consente l’imaging PET del traffico cellulare per oltre 1 settimana ed è prontamente prodotto dai ciclotroni medici a bassa energia ampiamente disponibili 13,14,15,16,17. Inoltre, un chelante p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina (DFO-Bn-NCS) opportunamente funzionalizzato è disponibile in commercio per la sintesi di un synthon marcato con 89 Zr, pronto all’uso, marcante con cellule, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina, noto anche come [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. Il principio della marcatura cellulare mediata da [89 Zr]Zr-DBN si basa su una reazione tra le ammine primarie delle proteine della membrana cellulare e la porzione isotiocianato (NCS) di [89Zr]Zr-DBN per produrre un legame tiourea covalente stabile.
[89Zr] L’etichettatura e l’imaging delle cellule basate su Zr-DBN sono state pubblicate per tracciare una varietà di cellule diverse, tra cui cellule staminali 18,23,25, cellule dendritiche18, cellule staminali cardiopoietiche19, cellule stromali deciduali 20, macrofagi derivati dal midollo osseo20, cellule mononucleate del sangue periferico 20, cellule T Jurkat/CAR 21, epatociti 22,24 e globuli bianchi 25. Il seguente protocollo fornisce metodi passo-passo per la preparazione e la radiomarcatura delle cellule con [89Zr]Zr-DBN e descrive le modifiche che possono essere richieste nel protocollo di radiomarcatura per un tipo di cellula specifico. Per maggiore chiarezza, il metodo di radiomarcatura delle cellule qui presentato è diviso in quattro sezioni. La prima sezione tratta della preparazione di [89 Zr]Zr-DBN mediante chelazione di 89Zr con DFO-Bn-NCS. La seconda sezione descrive la preparazione di una formulazione biocompatibile di [89Zr]Zr-DBN che può essere prontamente utilizzata per la radiomarcatura cellulare. La terza sezione riguarda le fasi necessarie per il precondizionamento delle cellule per la radiomarcatura. Il precondizionamento delle cellule comporta il lavaggio delle cellule con soluzione salina tamponata con fosfato privo di proteine (PBS) e soluzione salina bilanciata Hanks tamponata HEPES (H-HBSS) per rimuovere le proteine esterne, che potrebbero interferire o competere con la reazione di [89Zr]Zr-DBN con ammine primarie presenti sulle proteine della superficie cellulare durante la radiomarcatura. La sezione finale fornisce le fasi coinvolte nell’effettiva radiomarcatura delle cellule e nell’analisi del controllo di qualità.
Di seguito sono riportati i passaggi critici del protocollo che devono essere ottimizzati per un’efficace radiomarcatura cellulare. Nelle fasi 1.2 e 1.3 del protocollo, a seconda del volume di [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl4 impiegato, deve essere utilizzato un volume appropriato (microlitri) di base; La soluzione di 1,0 MK 2 CO 3 deve essere utilizzata per la neutralizzazione di [89 Zr]Zr(HPO 4)2 e la soluzione 1,0 M Na2 CO3</su…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 e sovvenzioni DOE DE-SC0008947, Agenzia Internazionale per l’Energia Atomica, Vienna, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Dipartimento di Radiologia e Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Tutte le figure sono state create utilizzando BioRender.com.
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |