מוצג כאן פרוטוקול לתאי רדיולייבל עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) רדיואיזוטופ, 89 Zr (t1/2 78.4 h), באמצעות סינתון רדיו-תיוג מוכן לשימוש, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). תיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN מאפשר מעקב לא פולשני והדמיה של תאים רדיו-מסומנים בגוף עם PET עד 7 ימים לאחר מתן התרופה.
טיפולים בתאי גזע וקולטן אנטיגן כימרי (CAR) לתאי T מסתמנים כטיפולים מבטיחים להתחדשות איברים וכאימונותרפיה לסוגי סרטן שונים. למרות התקדמות משמעותית שנעשתה בתחומים אלה, יש עוד מה ללמוד כדי להבין טוב יותר את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של התאים הטיפוליים המנוהלים במערכת החיה. עבור מעקב לא פולשני, in vivo של תאים עם טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), פותחה שיטה חדשה [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method באמצעות 89Zr (t 1/2 78.4 h). הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינתון [89Zr]Zr-DBN, מוכן לשימוש, לסימון רדיואקטיבי ישיר של מגוון תאים, כולל תאי גזע מזנכימליים, תאי גזע קרדיופויטיים מונחי שושלת, הפטוציטים המחדשים את הכבד, תאי דם לבנים, תאי מלנומה ותאים דנדריטיים. המתודולוגיה שפותחה מאפשרת הדמיית PET לא פולשנית של סחר בתאים עד 7 ימים לאחר מתן התרופה מבלי להשפיע על אופי או תפקוד התאים המסומנים ברדיו. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה מדורגת לרדיוסינתזה של [89 Zr]Zr-DBN, ניסוח תואם ביולוגית של [89 Zr]Zr-DBN, הכנת תאים לתיוג רדיו, ולבסוף תיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN, כולל כל הפרטים המורכבים הדרושים לתיוג רדיואקטיבי מוצלח של תאים.
טיפולי תאי גזע וקולטן אנטיגן כימרי (CAR) T-cell צוברים פופולריות ונמצאים תחת חקירה פעילה לטיפול במחלות שונות, כגון אי ספיקת שריר הלב1,2, ניוון רשתית 2, ניוון מקולרי 2, סוכרת 2, אוטם שריר הלב 3,4,5 וסרטן 6,7,8,9,10. בין שתי הגישות הסבירות של טיפולים בתאי גזע, תאי גזע יכולים להיות מושתלים ישירות באתר המחלה כדי לגרום לתגובה טיפולית, או לגרום לשינויים במיקרו-סביבה של אתר המחלה מבלי להיצמד לאתר המחלה כדי ליזום תגובה טיפולית עקיפה. תגובה טיפולית עקיפה עלולה לגרום לשינויים במיקרו-סביבה של אתר המחלה על ידי שחרור גורמים שיתקנו או יטפלו במחלה5. גישות אלה של טיפולים בתאי גזע יכולות להיות מוערכות על ידי הדמיה לא פולשנית של תאי גזע מסומנים רדיו. הדמיה לא פולשנית יכולה להתאים את ספיגת התאים הרדיואקטיביים באתר המחלה עם תגובה טיפולית לפענוח התגובה הטיפולית הישירה לעומת העקיפה.
בנוסף, טיפולים מבוססי תאי חיסון מפותחים לטיפול בסוגי סרטן שונים באמצעות CAR T-cell 6,7,8,9,10 ואימונותרפיה של תאים דנדריטיים 11,12. באופן מכניסטי, באימונותרפיהשל תאי T CAR 6,7,8,9,10, תאי T מהונדסים לבטא אפיטופ שנקשר לאנטיגן ספציפי על גידולים שיש לטפל בו. תאי CAR T מהונדסים אלה, עם נתינתם, נקשרים לאנטיגן הספציפי הקיים על תאי הגידול באמצעות אינטראקציה אפיטופית-אנטיגן. לאחר הקשירה, תאי ה-CAR T הקשורים עוברים הפעלה ולאחר מכן מתרבים ומשחררים ציטוקינים, מה שמאותת למערכת החיסון של המארח לתקוף את הגידול המבטא את האנטיגן הספציפי. לעומת זאת, במקרה של טיפולים בתאים דנדריטיים11,12, תאים דנדריטיים מהונדסים להציג אנטיגן סרטני ספציפי על פני השטח שלהם. תאים דנדריטיים מהונדסים אלה, כאשר הם מנוהלים, הם ביתם של בלוטות הלימפה ונקשרים לתאי T בבלוטות הלימפה. תאי T, עם קשירתם לאנטיגנים הסרטניים הספציפיים על התאים הדנדריטיים המנוהלים, עוברים הפעלה/התפשטות ויוזמים תגובה חיסונית של המאכסן כנגד הגידול המבטא את האנטיגן הספציפי. לפיכך, הערכת הסחר של תאי CAR T הניתנים לאתר גידול9,10 וביות של תאים דנדריטיים לבלוטות הלימפה11,12 אפשרית על ידי הדמיה רדיואקטיבית של תאי CAR T ותאים דנדריטיים כדי לקבוע את יעילות האימונותרפיה. יתר על כן, סחר לא פולשני בתאים יכול לעזור להבין טוב יותר את הפוטנציאל הטיפולי, להבהיר את התגובה הטיפולית הישירה לעומת העקיפה, ולחזות ולנטר את התגובה הטיפולית של טיפולים מבוססי תאי גזע ותאי חיסון.
שיטות הדמיה שונות לסחר בתאים נחקרו 3,4,9,10,12, כולל דימות אופטי, דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET). לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות וחסרונות משלה. מבין אלה, PET הוא המודל המבטיח ביותר בשל אופיו הכמותי ורגישותו הגבוהה, החיוניים לכימות אמין של תאים בסחר תאים מבוסס הדמיה 3,4,9,10.
רדיואיזוטופ פולט פוזיטרונים 89Zr, עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, מתאים לתיוג תאים. הוא מאפשר הדמיית PET של סחר בתאים במשך יותר משבוע אחד ומיוצר בקלות על ידי ציקלוטרון רפואי זמין באופן נרחב, אנרגיה נמוכה 13,14,15,16,17. בנוסף, כלטור p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) המתפקד כראוי זמין מסחרית לסינתזה של סינתון תיוג תאים 89 Zr, מוכן לשימוש, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, הידוע גם בשם [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. העיקרון של [89 Zr]Zr-DBN בתיווך תיוג תאים מבוסס על תגובה בין אמינים ראשוניים של חלבוני קרום התא לבין moiety איזותיוציאנט (NCS) של [89Zr]Zr-DBN כדי לייצר קשר קוולנטי יציב thiourea.
[89זר] תיוג והדמיית תאים מבוססי Zr-DBN פורסמו כדי לעקוב אחר מגוון תאים שונים, כולל תאי גזע 18,23,25, תאים דנדריטיים18, תאי גזע קרדיופויטיים19, תאי סטרומה נשירים 20, מקרופאגים שמקורם במח עצם 20, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים 20, תאי T Jurkat/CAR 21, הפטוציטים22,24 ותאי דם לבנים 25. הפרוטוקול הבא מספק שיטות שלב אחר שלב של הכנה ותיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN ומתאר שינויים שעשויים להידרש בפרוטוקול התיוג הרדיואקטיבי עבור סוג תא ספציפי. לקבלת בהירות רבה יותר, השיטה של radiolabeling התא המוצג כאן מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון עוסק בהכנת [89 Zr]Zr-DBN על ידי chelating 89Zr עם DFO-Bn-NCS. החלק השני מתאר את ההכנה של נוסחה תואמת ביולוגית של [89Zr]Zr-DBN שניתן להשתמש בה בקלות לתיוג רדיו של תאים. החלק השלישי מכסה את השלבים הדרושים להתניה מוקדמת של תאים לתיוג רדיו. ההתניה המוקדמת של התאים כרוכה בשטיפת התאים עם תמיסת מלח מבודדת ללא חלבון פוספט (PBS) ותמיסת מלח מאוזן HEPES חוצצת הנקס (H-HBSS) כדי להסיר חלבונים חיצוניים, אשר עשויים להפריע או להתחרות בתגובה של [89Zr]Zr-DBN עם אמינים ראשוניים הנמצאים על פני התא חלבונים במהלך תיוג רדיו. החלק האחרון מספק שלבים המעורבים ברדיותיוג בפועל של התאים וניתוח בקרת איכות.
להלן שלבים קריטיים בפרוטוקול הזקוקים לאופטימיזציה לתיוג רדיו תאי יעיל. בשלבי פרוטוקול 1.2 ו-1.3, בהתאם לנפח של [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4 שנעשה בו שימוש, יש להשתמש בנפח מתאים (מיקרוליטרים) של בסיס; יש להשתמש בתמיסת 1.0 M K 2 CO 3 לנטרול [89 Zr]Zr (HPO 4)2 ו- 1.0 M Na2CO3</…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, מענקי NIH R01HL134664 ו- DOE DE-SC0008947, הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית, וינה, המחלקה לרפואה גרעינית במאיו קליניק, המחלקה לרדיולוגיה ומרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, רוצ’סטר, מינסוטה. כל הדמויות נוצרו באמצעות BioRender.com.
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |