Tumorsphäroide werden zunehmend zur Beurteilung von Tumorzell-Mikroumgebung-Interaktionen und Therapiereaktionen eingesetzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine robuste, aber einfache Methode zur Semi-Hochdurchsatz-Bildgebung von 3D-Tumorsphäroiden mittels schneller optischer Clearing.
Tumorsphäroide werden in der Krebsgrundlagenforschung und Medikamentenentwicklung schnell alltäglich. Die Gewinnung von Daten über die Proteinexpression innerhalb des Sphäroids auf zellulärer Ebene ist wichtig für die Analyse, aber bestehende Techniken sind oft teuer, mühsam, verwenden nicht standardmäßige Geräte, verursachen signifikante Größenverzerrungen oder sind auf relativ kleine Sphäroide beschränkt. Dieses Protokoll stellt eine neue Methode zur Montage und Beseitigung von Sphäroiden vor, die diese Probleme angehen und gleichzeitig eine konfokale Analyse der inneren Struktur von Sphäroiden ermöglichen. Im Gegensatz zu bestehenden Ansätzen sieht dieses Protokoll eine schnelle Montage und Klärung einer großen Anzahl von Sphäroiden mit Standardausrüstung und Laborbedarf vor. Die Montage von Sphäroiden in einer pH-neutralen Agarose-PBS-Gellösung vor der Einführung einer Brechungsindex-angepassten Clearinglösung minimiert die Größenverzerrung, die bei anderen ähnlichen Techniken üblich ist. Dies ermöglicht eine detaillierte quantitative und statistische Analyse, bei der die Genauigkeit der Größenmessungen von größter Bedeutung ist. Darüber hinaus hält die Agarosegel-Technik im Vergleich zu flüssigen Clearing-Lösungen die Sphäroide an Ort und Stelle, was die Erfassung dreidimensionaler (3D) konfokaler Bilder ermöglicht. Der vorliegende Artikel erläutert, wie die Methode qualitativ hochwertige Zwei- und 3D-Bilder liefert, die Informationen über die Variabilität zwischen den Zellen und die innere Sphäroidstruktur liefern.
Dreidimensionale (3D) Zellkulturen, wie Sphäroide, liefern biologisch realistische und reproduzierbare Modelle des aggregierten Zellwachstums 1,2. Diese Modelle werden sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Arzneimittelentwicklung schnell alltäglich, wo Unterschiede in der Sphäroidgröße und -struktur zwischen den Behandlungen untersucht werden, um die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu ermitteln 3,4. In diesem Zusammenhang ist die Möglichkeit, detaillierte Informationen von einer großen Anzahl von Sphäroiden zu sammeln, sehr vorteilhaft, sowohl aus statistischer Sicht als auch um eine schnelle Beurteilung des Zellverhaltens über mehrere Behandlungen hinweg zu ermöglichen.
Häufig verwendete Techniken zur Gewinnung detaillierter Mikroskopiebilder der Sphäroidstruktur sind entweder zeitaufwendig, teuer oder erzeugen Bilder von schlechter Qualität, die wichtige quantitative Merkmale wie die Sphäroidgröße 4,5 nicht beibehalten. Zum Beispiel können histologische Techniken, die auf Kryosektion basieren, qualitativ hochwertige Bilder liefern, sind aber oft zeitaufwendig, erfordern qualifizierte Arbeit und erzeugen oft Schnittartefakte6,7, während elegante Technologien wie Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) 8 und Multiphotonenmikroskopie 9 spezielle Mikroskope erfordern, die nicht ohne weiteres verfügbar sind. Moderne Mikroskopietechnologien haben kürzlich das sogenannte optische Schneiden ermöglicht, bei dem Sphäroide in eine Brechungsindex-angepasste Clearinglösung platziert werden und Bilder mittels konfokaler Mikroskopieerhalten werden 4,5. Während diese Techniken das Potenzial haben, eine hohe Ausbeute zu erzielen, gehören zu den häufigsten Problemen die Sphäroidbewegung während der Bildgebung, die Größenverzerrung während des Clearings und die hohen Kosten proprietärer Clearing-Lösungen. Darüber hinaus gelten viele bestehende Protokolle nur für relativ kleine Sphäroide mit einem Durchmesser von weniger als 300 μm oder einer Tiefe von bis zu 100 μm, wodurch die Technologie auf die frühen Stadien des Tumorwachstumsbeschränkt ist 5,10,11.
Das vorliegende Protokoll ermöglicht eine Semi-High-Throughput-High-Yield-Sammlung detaillierter Sphäroidbilder unter Verwendung einer kostengünstigen, auf den Brechungsindex abgestimmten Clearinglösung, die aus Clearingverfahren für ganze Organe abgeleitet wurde12,13. Um die Bewegung von Sphäroid während der Bildgebung zu verhindern und strukturelle Unterstützung zur Verringerung der Größenverzerrung zu bieten, sind die Sphäroide in Agarose-PBS-Gel in einer 24-Well # 1.5-Glasbodenplatte montiert. Da diese Technik es ermöglicht, mehrere Sphäroide in jedem Bohrloch in einer 24-Well-Platte zu montieren, können bis zu 360 Sphäroide (15 Sphäroide / Well) schnell montiert und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen abgebildet werden. Eine auf den Brechungsindex abgestimmte Clearinglösung, die aus leicht verfügbaren Verbrauchsmaterialien besteht, wird verwendet, um montierte Sphäroide und das umgebende Gel optisch zu entfernen. Nach einer Einschwingzeit von 24 h liefert dieses Protokoll hochwertige 2D- und 3D-Bilder der Sphäroidstruktur, selbst für relativ große Sphäroide (ca. 700 μm Durchmesser), mit weniger als 2% Größenverzerrung.
Ein Protokoll zur Gewinnung hochwertiger zwei- und dreidimensionaler Bilder von Tumorsphäroiden wird hier vorgestellt. Bestehende Methoden wie CLARITY, See deep brain (SeeDB) und ScaleS verursachen oft eine Größenverzerrung um bis zu 30%, während Techniken wie Benzylalkohol / Benzylbenzoat (BABB) und 3D-Bildgebung von lösungsmittelgeclearten Organen (3DISCO) fluoreszierendes Protein18 löschen können. Viele dieser Methoden sind darauf ausgelegt, Gewebe mit struktureller Integrität zu reinigen und die Größe und Struktur zu verzerren, wenn sie auf Sphäroide18 angewendet werden. Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die kommerziell erhältliche teure Clearing-Lösungen verwenden, verwendet dieses Protokoll leicht verfügbare Verbrauchsmaterialien unter Beibehaltung der optischen Klarheit und der endogenen Fluoreszenz und minimiert die Größenverzerrung. Die Einbettung von Sphäroiden in Agarose-PBS-Gel bietet strukturelle Unterstützung für Sphäroide und minimiert den osmotischen Schock, wenn die Clearinglösung hinzugefügt wird. Dies ist entscheidend bei der Abbildung von zerbrechlichen Sphäroiden nach der medikamentösen Behandlung. Es wird angenommen, dass diese optische Clearingmethode für Sphäroide geeignet ist, die mit einer beliebigen Methode gebildet werden, da dieses Protokoll von der Reinigung des gesamten Gewebes übernommen wurde. Die Annahme basiert auf der Ähnlichkeit der Sphäroide, die durch verschiedene Sphäroidbildungsmethoden erhalten werden. Die Wahl des Fixativums kann die Sphäroidgröße sowie die endogene Fluoreszenz beeinflussen. Diese Clearingmethode eignet sich für Sphäroide, die mit neutraler 4%iger PFA-Lösung fixiert sind. Weitere Tests sind erforderlich, um die Kompatibilität mit anderen Fixiermitteln zu überprüfen.
Da diese Technik es ermöglicht, mehrere Sphäroide gleichzeitig in einer Multi-Well-Platte zu montieren, eignet sie sich gut für quantitative Analysepipelines, die Sphäroidstrukturinformationen von bis zu 360 Sphäroiden pro 24-Well-Platte erfordern. Mikroskope mit automatisierten Tisch- und Plattenkartierungsfunktionen können die Bildgebung weniger manuell machen. Obwohl diese Methode schneller und einfacher ist als das Schneiden, ist sie derzeit für eine vollständige Automatisierung ungeeignet. Die mit diesem Verfahren erhaltenen Bilder eignen sich jedoch für die automatisierte Bildverarbeitung 4,19, und die Geschwindigkeit, mit der Sphäroide mit diesem Protokoll montiert werden können, ermöglicht eine quantitative Analyse der Sphäroid-Innenstruktur20,21,22.
Für die Färbung ganzer Sphäroide müssen die Antikörperkonzentration, das Volumen und die Inkubationszeit für jeden Antikörper optimiert werden. Verwenden Sie als Leitfaden 2,5x der empfohlenen 2D-Immunfluoreszenz-Antikörperkonzentration und 100-200 μL Antikörper, abhängig von der Anzahl der Sphäroide pro Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass alle Sphäroide auf dem Rotor mit Färbelösung bedeckt sind. Die Inkubationszeit hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe und Dichte von Sphäroiden und des Antikörpers, und kann zwischen 16 und 72 h liegen. Trotz der Methode, die eine Signaldetektion tiefer im Sphäroid ermöglicht, verursachen durch UV angeregte Fluorophore eine signifikante Lichtstreuung, was zu einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis führt. Bei der Auswahl von Fluorophoren ist Vorsicht geboten, um das Zielprotein sichtbar zu machen. Zum Beispiel wird die Färbung von weniger reichlich vorhandenen und strukturellen Proteinen mit längerwelligen Fluorophoren und mehr reichlich vorhandenem Protein oder Kernflecken mit kürzerwelligen Fluorophoren das beste Ergebnis erzielen. Schließlich zeigen gereinigte Sphäroide immer noch Lichtverluste aufgrund von Streuung im nekrotischen Kern, was sich in der y/z-Dimension von Bildern von 600 μm Sphäroiden zeigt (Abbildung 2C).
Bildgebung mit höherer Vergrößerung mit höheren NA-Objektiven ist mit Sphäroiden möglich, die mit diesem Protokoll montiert und gelöscht werden, aber der Arbeitsabstand des Objektivs begrenzt die Abbildungstiefe. Für eine Öltauchlinse ist es wichtig, Öl zu verwenden, das einen RI von 1,51 hat, um das beste Ergebnis zu erzielen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die eingebettete Agarose-PBS-Gel-Clearing-Methode die Visualisierung von Zellen tief in Sphäroiden mit allgemein verfügbaren Verbrauchsmaterialien ermöglicht. Sphäroide, die mit dieser Methode montiert und gelöscht werden, unterliegen einer minimalen Größenverzerrung und behalten ihre strukturelle Integrität bei, was die Erfassung hochwertiger Daten in Bezug auf die innere Sphäroidstruktur und die anschließende automatisierte Quantifizierung ermöglicht.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde am Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD, durchgeführt. TRI wird durch einen Zuschuss der australischen Regierung unterstützt. Wir danken den Mitarbeitern in der Kerneinrichtung für Mikroskopie bei TRI für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, für die Bereitstellung der FUCCI-Konstrukte, Prof. Meenhard Herlyn und Frau Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, für die Bereitstellung der Zelllinien. Wir danken Dr. Loredana Spoerri für die Bereitstellung von C8161-Kryosegmentbildern.
Diese Arbeit wurde durch Projektzuschüsse an N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) und Meehan Project Grant (021174 2017002565) unterstützt.
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |