肿瘤球体越来越多地用于评估肿瘤细胞 – 微环境相互作用和治疗反应。本方案描述了一种使用快速光学清除对3D肿瘤球体进行半高通量成像的稳健但简单的方法。
肿瘤球体在基础癌症研究和药物开发中正迅速变得司空见惯。在细胞水平上获取有关球体内蛋白质表达的数据对于分析非常重要,但现有技术通常昂贵,费力,使用非标准设备,导致显着的尺寸失真,或仅限于相对较小的球体。该协议提出了一种安装和清除球体的新方法,可以解决这些问题,同时允许对球体的内部结构进行共聚焦分析。与现有方法相比,该协议提供了使用标准设备和实验室用品快速安装和清除大量球体的功能。在引入折射率匹配的透明溶液之前,将球体安装在pH中性琼脂糖- PBS凝胶溶液中,可最大限度地减少其他类似技术常见的尺寸失真。这允许进行详细的定量和统计分析,其中尺寸测量的准确性至关重要。此外,与液体清除溶液相比,琼脂糖凝胶技术将球体固定到位,从而可以收集三维(3D)共聚焦图像。本文详细介绍了该方法如何产生高质量的二维和三维图像,这些图像提供有关细胞间变异性和内部球体结构的信息。
三维(3D)细胞培养物,如球状体,提供生物上真实且可重复的聚集细胞生长模型1,2。这些模型在基础研究和药物开发中迅速变得司空见惯,其中在治疗之间检查球体大小和结构的差异,以确定药物疗效3,4。在这些情况下,从大量球体收集详细信息的能力是非常有利的,无论是从统计功效的角度来看,还是允许快速评估几种治疗中的细胞行为。
用于获取球体结构的详细显微镜图像的常用技术要么耗时,要么昂贵,要么产生的质量较差的图像不保留关键定量特征,例如球体大小4,5。例如,基于冷冻切片的组织学技术可以提供高质量的图像,但通常非常耗时,需要熟练的劳动力,并且经常创建切片伪影6,7,而优雅的技术,如单平面照明显微镜(SPIM)8 和多光子显微镜9 需要不容易获得的专用显微镜。现代显微镜技术最近实现了所谓的光学切片,其中将球体放置在折射率匹配的透明溶液中,并使用共聚焦显微镜4,5获得图像。虽然这些技术有可能产生高产量,但常见问题包括成像时的球体移动,清除时的大小失真以及专有清除解决方案的高成本。此外,许多现有方案仅适用于直径小于300μm或深度高达100μm的相对较小的球体,将该技术限制在肿瘤生长的早期阶段5,10,11。
本方案允许使用源自整个器官清除程序12、13的低成本折射率匹配的清除溶液对详细的球体图像进行半高通量、高产量的收集。为了防止成像过程中的球体移动并提供结构支撑以减少尺寸变形,将球体安装在24孔#1.5玻璃底板中的琼脂糖-PBS凝胶中。由于该技术允许在24孔板的每个孔中安装多个球体,因此可以在各种实验条件下快速安装多达360个球体(15个球体/孔)并进行成像。由现成的耗材构成的折射率匹配的透明溶液用于以光学方式清除已安装的球体和周围的凝胶。在24小时的沉降期后,该协议提供高质量的球状结构的2D和3D图像,即使对于相对较大的球体(直径约700μm),尺寸失真小于2%。
这里介绍了用于获得肿瘤球体的高质量二维和三维图像的方案。现有的方法,如清晰度,见深脑(SeeDB)和ScaleS,通常会导致高达30%的大小失真,而苯甲醇/苯甲酸苄酯(BABB)和溶剂清除器官的3D成像(3DISCO)等技术可以淬灭荧光蛋白18。这些方法中的许多被设计用于清除具有结构完整性的组织,并且在应用于球体18时扭曲大小和结构。与使用市售昂贵清除解决方案的其他方案相比,该方案使用现成的消耗品,同时保持光学清晰度和内源性荧光,并最大限度地减少尺寸失真。在琼脂糖-PBS凝胶中包埋球体可为球状体提供结构支持,并在添加清除溶液时最大限度地减少渗透冲击。在药物治疗后对脆弱的球体进行成像时,这一点至关重要。假设该光学清除方法适用于由任何方法形成的球体,因为该方案适用于整个组织清除。该假设基于通过不同球体形成方法获得的球体的相似性。固定剂的选择会影响球体大小以及内源性荧光。这种清除方法适用于用中性4%PFA溶液固定的球体。需要进一步测试以检查其与其他固定剂的相容性。
鉴于该技术允许在多孔板中同时安装多个球体,因此它非常适合需要每个24孔板多达360个球体结构信息的定量分析管道。具有自动载物台和板映射功能的显微镜可以减少成像的手动操作。尽管这种方法比切片更快,更容易,但它目前不适合完全自动化。然而,通过这种方法获得的图像适用于自动图像处理4,19,并且使用该协议可以安装球体的速率有助于对球体内部结构20,21,22进行定量分析。
对于整个球体的染色,需要针对每种抗体优化抗体浓度、体积和孵育时间。作为指导,使用推荐的2D免疫荧光抗体浓度的2.5倍和100-200μL抗体,具体取决于每管的球体数量。确保在转子上时所有球体都覆盖在染色溶液中。孵育时间取决于许多因素,包括球体和抗体的大小和密度,范围为16-72小时。尽管该方法允许在球体内部更深处进行信号检测,但由紫外线激发的荧光团会引起明显的光散射,从而导致低信噪比。选择荧光基团以可视化目标蛋白时必须小心。例如,染色具有较长波长荧光团的较丰富和结构蛋白以及具有较短波长荧光团的更丰富的蛋白质或核染色剂将获得最佳结果。最后,清除的球体仍然由于坏死核心中的散射而显示光损失,这在600μm球体获得的图像的y / z维中很明显(图2C)。
使用该协议安装和清除球体时,可以使用更高的数值孔径进行更高放大倍率的成像,但物镜的工作距离限制了成像深度。对于油浸式镜头,使用RI为1.51的油以获得最佳效果非常重要。
总而言之,琼脂糖-PBS凝胶包埋清除方法允许使用常用的耗材对球体深处的细胞进行可视化。使用这种方法安装和清除的球体经历最小的尺寸变形并保持其结构完整性,允许收集与内部球体结构相关的高质量数据并随后进行自动定量。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是在昆士兰州乌龙戈巴的转化研究所(TRI)进行的。TRI由澳大利亚政府赠款支持,我们感谢TRI显微镜核心设施的工作人员提供出色的技术支持。我们感谢日本和光市RIKEN的宫亩教授提供FUCCI结构,宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所的米恩哈德·赫林教授和帕特里夏·布拉福德女士提供细胞系。我们感谢洛雷达娜·斯波尔里博士提供C8161冷冻切片图像。
这项工作得到了向N.K.H.的项目赠款的支持:澳大利亚研究委员会(DP200100177)和Meehan项目赠款(021174 2017002565)。
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |