Les sphéroïdes tumoraux sont de plus en plus utilisés pour évaluer les interactions cellule tumorale-microenvironnement et la réponse thérapeutique. Le présent protocole décrit une méthode robuste mais simple pour l’imagerie à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux 3D en utilisant un nettoyage optique rapide.
Les sphéroïdes tumoraux deviennent rapidement monnaie courante dans la recherche fondamentale sur le cancer et le développement de médicaments. L’obtention de données concernant l’expression des protéines dans le sphéroïde au niveau cellulaire est importante pour l’analyse, mais les techniques existantes sont souvent coûteuses, laborieuses, utilisent un équipement non standard, provoquent une distorsion de taille importante ou sont limitées à des sphéroïdes relativement petits. Ce protocole présente une nouvelle méthode de montage et de nettoyage des sphéroïdes qui répondent à ces problèmes tout en permettant une analyse confocale de la structure interne des sphéroïdes. Contrairement aux approches existantes, ce protocole prévoit le montage et le nettoyage rapides d’un grand nombre de sphéroïdes à l’aide d’équipements standard et de fournitures de laboratoire. Le montage de sphéroïdes dans une solution de gel d’agarose-PBS au pH neutre avant d’introduire une solution de nettoyage adaptée à l’indice de réfraction minimise la distorsion de taille commune à d’autres techniques similaires. Cela permet une analyse quantitative et statistique détaillée où la précision des mesures de taille est primordiale. De plus, par rapport aux solutions de nettoyage liquide, la technique du gel d’agarose maintient les sphéroïdes fixés en place, ce qui permet la collecte d’images confocales tridimensionnelles (3D). Le présent article explique comment la méthode produit des images bi- et 3D de haute qualité qui fournissent des informations sur la variabilité intercellulaire et la structure sphéroïde interne.
Les cultures cellulaires tridimensionnelles (3D), telles que les sphéroïdes, fournissent des modèles biologiquement réalistes et reproductibles de la croissance cellulaire agrégée 1,2. Ces modèles deviennent rapidement monnaie courante dans la recherche fondamentale et le développement de médicaments, où les différences de taille et de structure des sphéroïdes sont examinées entre les traitements pour déterminer l’efficacité des médicaments 3,4. Dans ces contextes, la capacité de collecter des informations détaillées à partir d’un grand nombre de sphéroïdes est très avantageuse, à la fois du point de vue de la puissance statistique et pour permettre une évaluation rapide du comportement cellulaire à travers plusieurs traitements.
Les techniques couramment utilisées pour obtenir des images microscopiques détaillées de la structure sphéroïde prennent du temps, sont coûteuses ou produisent des images de mauvaise qualité qui ne conservent pas les principales caractéristiques quantitatives telles que la taille des sphéroïdes 4,5. Par exemple, les techniques histologiques basées sur la cryosection peuvent fournir des images de haute qualité, mais prennent souvent beaucoup de temps, nécessitent une main-d’œuvre qualifiée et créent souvent des artefacts de sectionnement 6,7, tandis que les technologies élégantes, telles que la microscopie à éclairage monoplan (SPIM)8 et la microscopie multiphotonique9 nécessitent des microscopes spécialisés qui ne sont pas facilement disponibles. Les technologies modernes de microscopie ont récemment permis ce que l’on appelle la section optique, où les sphéroïdes sont placés dans une solution de nettoyage appariée à l’indice de réfraction et les images sont obtenues à l’aide de la microscopie confocale 4,5. Bien que ces techniques aient le potentiel de produire un rendement élevé, les problèmes courants incluent le mouvement des sphéroïdes lors de l’imagerie, la distorsion de la taille lors du nettoyage et le coût élevé des solutions de nettoyage propriétaires. En outre, de nombreux protocoles existants ne s’appliquent qu’aux sphéroïdes relativement petits de moins de 300 μm de diamètre ou de profondeur jusqu’à 100 μm, limitant la technologie aux premiers stades de la croissance tumorale 5,10,11.
Le présent protocole permet la collecte à semi-haut débit et à haut rendement d’images sphéroïdes détaillées à l’aide d’une solution de compensation à indice de réfraction à faible coût dérivée de procédures de nettoyage d’organes entiers12,13. Pour empêcher le mouvement des sphéroïdes pendant l’imagerie et fournir un support structurel pour réduire la distorsion de taille, les sphéroïdes sont montés dans un gel agarose-PBS dans une plaque inférieure en verre #1.5 de 24 puits. Étant donné que cette technique permet de monter plusieurs sphéroïdes dans chaque puits dans une plaque de 24 puits, jusqu’à 360 sphéroïdes (15 sphéroïdes / puits) peuvent être rapidement montés et imagés dans diverses conditions expérimentales. Une solution de nettoyage adaptée à l’indice de réfraction, construite à partir de consommables facilement disponibles, est utilisée pour éliminer optiquement les sphéroïdes montés et le gel environnant. Après une période de décantation de 24 h, ce protocole fournit des images 2D et 3D de haute qualité de la structure sphéroïde, même pour les sphéroïdes relativement grands (environ 700 μm de diamètre), avec moins de 2% de distorsion de taille.
Un protocole pour obtenir des images bidimensionnelles et tridimensionnelles de haute qualité des sphéroïdes tumoraux est présenté ici. Les méthodes existantes, telles que CLARITY, See deep brain (SeeDB) et ScaleS, provoquent souvent une distorsion de taille allant jusqu’à 30%, tandis que des techniques telles que l’alcool benzylique / benzoate de benzyle (BABB) et l’imagerie 3D d’organes éliminés par solvant (3DISCO) peuvent éteindre la protéine fluorescente18. Beaucoup de ces méthodes sont conçues pour nettoyer les tissus avec intégrité structurelle et déformer la taille et la structure lorsqu’elles sont appliquées aux sphéroïdes18. Contrairement à d’autres protocoles qui utilisent des solutions de compensation coûteuses disponibles dans le commerce, ce protocole utilise des consommables facilement disponibles tout en maintenant la clarté optique et la fluorescence endogène et en minimisant la distorsion de taille. L’incorporation de sphéroïdes dans le gel agarose-PBS fournit un soutien structurel aux sphéroïdes et minimise le choc osmotique lorsque la solution de nettoyage est ajoutée. Ceci est crucial lors de l’imagerie de sphéroïdes fragiles après un traitement médicamenteux. On suppose que cette méthode de nettoyage optique convient aux sphéroïdes formés par n’importe quelle méthode puisque ce protocole est adapté de la clairance des tissus entiers. L’hypothèse est basée sur la similitude dans les sphéroïdes obtenue par différentes méthodes de formation des sphéroïdes. Le choix du fixateur peut affecter la taille du sphéroïde ainsi que la fluorescence endogène. Cette méthode de nettoyage convient aux sphéroïdes fixés avec une solution neutre de PFA à 4%. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour vérifier sa compatibilité avec d’autres fixateurs.
Étant donné que cette technique permet de monter simultanément plusieurs sphéroïdes dans une plaque multi-puits, elle est bien adaptée aux pipelines d’analyse quantitative qui nécessitent des informations sur la structure des sphéroïdes allant jusqu’à 360 sphéroïdes par plaque de 24 puits. Les microscopes dotés de fonctions automatisées de cartographie des scènes et des plaques peuvent rendre l’imagerie moins manuelle. Même si cette méthode est plus rapide et plus facile que le sectionnement, elle est actuellement inadaptée à une automatisation complète. Cependant, les images obtenues par cette méthode conviennent au traitement automatiséd’images 4,19, et la vitesse à laquelle les sphéroïdes peuvent être montés à l’aide de ce protocole permet une analyse quantitative de la structure interne des sphéroïdes 20,21,22.
Pour colorer les sphéroïdes entiers, la concentration, le volume et le temps d’incubation des anticorps doivent être optimisés pour chaque anticorps. À titre indicatif, utilisez 2,5 fois la concentration recommandée d’anticorps d’immunofluorescence 2D et 100 à 200 μL d’anticorps, selon le nombre de sphéroïdes par tube. Assurez-vous que tous les sphéroïdes sont recouverts d’une solution de coloration lorsqu’ils sont sur le rotor. Le temps d’incubation dépend de nombreux facteurs, y compris la taille et la densité des sphéroïdes et de l’anticorps, et peut varier de 16 à 72 h. Malgré la méthode permettant la détection du signal plus profondément dans le sphéroïde, les fluorophores excités par les UV provoquent une diffusion importante de la lumière, conduisant à un faible rapport signal/bruit. Lors du choix des fluorophores, il faut prendre soin de visualiser la protéine cible. Par exemple, la coloration de protéines moins abondantes et structurelles avec des fluorophores de plus grande longueur d’onde et des protéines plus abondantes ou des taches nucléaires avec des fluorophores de longueur d’onde plus courte permettra d’obtenir le meilleur résultat. Enfin, les sphéroïdes nettoyés montrent toujours une perte de lumière due à la diffusion dans le noyau nécrotique, évidente dans la dimension y/z des images obtenues de sphéroïdes de 600 μm (Figure 2C).
Une imagerie à grossissement plus élevé avec des objectifs NA plus élevés est possible avec des sphéroïdes montés et effacés à l’aide de ce protocole, mais la distance de travail de l’objectif limite la profondeur d’imagerie. Pour une lentille d’immersion dans l’huile, il est important d’utiliser de l’huile qui a un RI de 1,51 pour le meilleur résultat.
Pour résumer, la méthode de nettoyage intégré au gel agarose-PBS permet de visualiser les cellules profondément à l’intérieur des sphéroïdes à l’aide de consommables couramment disponibles. Les sphéroïdes montés et éliminés à l’aide de cette méthode subissent une distorsion de taille minimale et maintiennent leur intégrité structurelle, ce qui permet la collecte de données de haute qualité relatives à la structure sphéroïde interne et une quantification automatisée ultérieure.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été réalisée à l’Institut de recherche translationnelle (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI est soutenu par une subvention du gouvernement australien. Nous remercions le personnel de l’installation centrale de microscopie de TRI pour son soutien technique exceptionnel. Nous remercions le professeur Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japon, pour avoir fourni les constructions FUCCI, le professeur Meenhard Herlyn et Mme Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphie, PA, pour avoir fourni les lignées cellulaires. Nous remercions le Dr Loredana Spoerri d’avoir fourni des images de cryosection C8161.
Ce travail a été soutenu par des subventions de projet à N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) et Meehan Project Grant (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |