أصبحت كرويات الورم تستخدم بشكل متزايد لتقييم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة والاستجابة للعلاج. يصف البروتوكول الحالي طريقة قوية ولكنها بسيطة للتصوير شبه عالي الإنتاجية للكرويات 3D للورم باستخدام التطهير البصري السريع.
أصبحت الأورام الكروية شائعة بسرعة في أبحاث السرطان الأساسية وتطوير الأدوية. يعد الحصول على البيانات المتعلقة بتعبير البروتين داخل الكروية على المستوى الخلوي أمرا مهما للتحليل ، ومع ذلك فإن التقنيات الحالية غالبا ما تكون باهظة الثمن أو شاقة أو تستخدم معدات غير قياسية أو تسبب تشويها كبيرا في الحجم أو تقتصر على كرويات صغيرة نسبيا. يقدم هذا البروتوكول طريقة جديدة لتركيب وإزالة الكرويات التي تعالج هذه القضايا مع السماح بالتحليل البؤري للبنية الداخلية للكرويات. وعلى النقيض من النهج القائمة، ينص هذا البروتوكول على التركيب السريع لعدد كبير من الكرويات وتطهيرها باستخدام المعدات القياسية ولوازم المختبرات. إن تركيب الكرويات في محلول هلام أغاروز-PBS محايد الأس الهيدروجيني قبل إدخال حل مقاصة مطابق لمؤشر الانكسار يقلل من تشويه الحجم الشائع في التقنيات المماثلة الأخرى. وهذا يسمح بإجراء تحليل كمي وإحصائي مفصل حيث تكون دقة قياسات الحجم ذات أهمية قصوى. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع حلول إزالة السوائل ، تحافظ تقنية هلام الأغاروز على تثبيت الكرويات في مكانها ، مما يسمح بجمع الصور البؤرية ثلاثية الأبعاد (3D). توضح هذه المقالة كيف تنتج الطريقة صورا عالية الجودة ثنائية و 3D توفر معلومات حول التباين بين الخلايا والبنية الكروية الداخلية.
توفر مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) ، مثل الكرويات ، نماذج واقعية بيولوجيا وقابلة للتكرار لنمو الخلايا الكلي 1,2. أصبحت هذه النماذج شائعة بسرعة في كل من البحوث الأساسية وتطوير الأدوية ، حيث يتم فحص الاختلافات في حجم الكروية وهيكلها بين العلاجات للتأكد من فعالية الدواء 3,4. في هذه السياقات ، تعد القدرة على جمع معلومات مفصلة من عدد كبير من الكرويات مفيدة للغاية ، سواء من منظور القوة الإحصائية أو للسماح بالتقييم السريع لسلوك الخلية عبر العديد من العلاجات.
التقنيات الشائعة الاستخدام للحصول على صور مجهرية مفصلة للبنية الكروية إما تستغرق وقتا طويلا أو مكلفة أو تنتج صورا ذات جودة رديئة لا تحتفظ بالميزات الكمية الرئيسية مثل الحجم الكروي 4,5. على سبيل المثال، يمكن للتقنيات النسيجية القائمة على التقسيم بالتبريد أن توفر صورا عالية الجودة ولكنها غالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وتتطلب عمالة ماهرة، وغالبا ما تنشئ قطعا أثرية مجزأة 6,7، في حين أن التقنيات الأنيقة، مثل مجهر الإضاءة أحادية المستوى (SPIM)8 والمجهر متعدد الفوتونات9 تتطلب مجاهر متخصصة غير متوفرة بسهولة. وقد مكنت تقنيات الفحص المجهري الحديثة مؤخرا ما يسمى بالتقسيم البصري ، حيث يتم وضع الكرويات داخل محلول إزالة مطابق لمعامل الانكسار ويتم الحصول على الصور باستخدام المجهر البؤري 4,5. في حين أن هذه التقنيات لديها القدرة على إنتاج عائد مرتفع ، فإن المشاكل الشائعة تشمل الحركة الكروية أثناء التصوير ، وتشويه الحجم أثناء التطهير ، والتكلفة العالية لحلول المقاصة الخاصة. علاوة على ذلك ، تنطبق العديد من البروتوكولات الحالية فقط على الكرويات الصغيرة نسبيا التي يقل قطرها عن 300 ميكرومتر أو عمقها حتى 100 ميكرومتر ، مما يحد من التكنولوجيا إلى المراحل المبكرة من نمو الورم5،10،11.
يسمح البروتوكول الحالي بجمع صور كروية مفصلة ذات إنتاجية عالية وإنتاجية عالية باستخدام حل مقاصة مطابق لمعامل الانكسار منخفض التكلفة مشتق من إجراءات تطهير الأعضاء بأكملها12,13. لمنع الحركة الكروية أثناء التصوير وتوفير الدعم الهيكلي لتقليل تشويه الحجم ، يتم تركيب الكرويات في هلام agarose-PBS في لوحة سفلية زجاجية 24 بئر # 1.5. نظرا لأن هذه التقنية تسمح بتركيب كرويات متعددة في كل بئر في لوحة مكونة من 24 بئرا ، يمكن تركيب ما يصل إلى 360 كرويا (15 كرويا / بئرا) بسرعة وتصويرها عبر ظروف تجريبية مختلفة. يتم استخدام حل المقاصة المطابق لمعامل الانكسار المبني من المواد الاستهلاكية المتاحة بسهولة لمسح الكرويات المثبتة والجل المحيط بها بصريا. بعد فترة استقرار مدتها 24 ساعة ، يوفر هذا البروتوكول صورا ثنائية الأبعاد و 3D عالية الجودة للبنية الكروية ، حتى بالنسبة للكرويات الكبيرة نسبيا (قطرها حوالي 700 ميكرومتر) ، مع تشويه حجم أقل من 2٪.
يتم تقديم بروتوكول للحصول على صور ثنائية وثلاثية الأبعاد عالية الجودة للكرويات السرطانية هنا. غالبا ما تتسبب الطرق الحالية ، مثل CLARITY و See deep brain (SeeDB) و ScaleS ، في تشويه الحجم بنسبة تصل إلى 30٪ ، في حين أن تقنيات مثل Benzyl Alcohol / Benzyl Benzoate (BABB) والتصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات (3DISCO) يمكن أن تطفئ بروتين الفلورسنت18. تم تصميم العديد من هذه الطرق لإزالة الأنسجة ذات السلامة الهيكلية وتشويه الحجم والبنية عند تطبيقها على الكرويات18. وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى التي تستخدم حلول المقاصة باهظة الثمن المتاحة تجاريا، يستخدم هذا البروتوكول المواد الاستهلاكية المتاحة بسهولة مع الحفاظ على الوضوح البصري والتألق الداخلي وتقليل تشويه الحجم. يوفر تضمين الكرويات في هلام agarose-PBS دعما هيكليا للكرويات ويقلل من الصدمة التناضحية عند إضافة محلول المقاصة. هذا أمر بالغ الأهمية عند تصوير الكرويات الهشة بعد العلاج من تعاطي المخدرات. من المفترض أن طريقة التطهير البصري هذه مناسبة للكرويات التي تشكلها أي طريقة لأن هذا البروتوكول مقتبس من تطهير الأنسجة بالكامل. يعتمد الافتراض على التشابه في الكرويات التي تم الحصول عليها بطرق تكوين كروية مختلفة. يمكن أن يؤثر اختيار المثبت على حجم الكروي وكذلك التألق الداخلي. طريقة المقاصة هذه مناسبة للكرويات الثابتة بمحلول PFA محايد بنسبة 4٪. مطلوب مزيد من الاختبارات للتحقق من توافقه مع المثبتات الأخرى.
وبالنظر إلى أن هذه التقنية تسمح بتركيب كرويات متعددة في وقت واحد في صفيحة متعددة الآبار، فهي مناسبة تماما لخطوط أنابيب التحليل الكمي التي تتطلب معلومات الهيكل الكروي من ما يصل إلى 360 كرويا لكل صفيحة من 24 بئرا. يمكن للمجاهر ذات وظائف رسم خرائط المراحل والصفائح الآلية أن تجعل التصوير أقل يدويا. على الرغم من أن هذه الطريقة أسرع وأسهل من التقسيم ، إلا أنها غير مناسبة حاليا للأتمتة الكاملة. ومع ذلك ، فإن الصور التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة مناسبة لمعالجة الصور الآلية 4,19 ، والمعدل الذي يمكن به تركيب الكرويات باستخدام هذا البروتوكول يفسح المجال للتحليل الكمي للبنية الداخلية الكروية20,21,22.
لتلطيخ الكرويات الكاملة ، يجب تحسين تركيز الأجسام المضادة وحجمها ووقت حضانتها لكل جسم مضاد. كدليل ، استخدم 2.5x من تركيز الأجسام المضادة المناعية 2D الموصى به و 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة ، اعتمادا على عدد الكرويات لكل أنبوب. تأكد من تغطية جميع الكرويات بمحلول تلطيخ عندما تكون على الدوار. يعتمد وقت الحضانة على العديد من العوامل ، بما في ذلك حجم وكثافة الكرويات والأجسام المضادة ، ويمكن أن يتراوح من 16-72 ساعة. على الرغم من الطريقة التي تسمح باكتشاف الإشارة بشكل أعمق داخل الكروية ، إلا أن الفلوروفورات التي تثيرها الأشعة فوق البنفسجية تسبب تشتتا كبيرا للضوء ، مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. يجب توخي الحذر عند اختيار الفلوروفورات لتصور البروتين المستهدف. على سبيل المثال ، فإن تلطيخ البروتينات الأقل وفرة والهيكلية مع الفلوروفورات ذات الطول الموجي الأطول والمزيد من البروتين أو البقع النووية مع الفلوروفورات ذات الطول الموجي الأقصر سيحقق أفضل نتيجة. وأخيرا، لا تزال الكرويات التي تم تطهيرها تظهر فقدان الضوء بسبب التشتت في النواة الميتة، وهو ما يتضح في البعد y/z للصور التي تم الحصول عليها من 600 ميكرومتر كروية (الشكل 2C).
يمكن التصوير بالتكبير العالي مع أهداف NA أعلى باستخدام الكرويات المثبتة ومسحها باستخدام هذا البروتوكول ، ولكن مسافة عمل الهدف تحد من عمق التصوير. بالنسبة لعدسة غمر الزيت ، من المهم استخدام الزيت الذي يحتوي على مثيل محجوز يبلغ 1.51 للحصول على أفضل نتيجة.
للتلخيص ، تسمح طريقة إزالة هلام agarose-PBS المضمنة بتصور الخلايا العميقة داخل الكرويات باستخدام المواد الاستهلاكية المتاحة بشكل شائع. تخضع الكرويات المثبتة والمسحة باستخدام هذه الطريقة لتشويه الحد الأدنى من الحجم والحفاظ على سلامتها الهيكلية ، مما يسمح بجمع بيانات عالية الجودة تتعلق بالهيكل الكروي الداخلي والقياس الكمي الآلي اللاحق.
The authors have nothing to disclose.
تم إجراء هذا البحث في معهد البحوث الانتقالية (TRI) ، Woolloongabba ، QLD. يتم دعم TRI بمنحة من الحكومة الأسترالية. نشكر الموظفين في المرفق الأساسي للفحص المجهري في TRI على دعمهم الفني المتميز. نشكر البروفيسور أتسوشي مياواكي ، ريكين ، مدينة واكو ، اليابان ، على توفير هياكل FUCCI ، والبروفيسور مينهارد هيرلين والسيدة باتريشيا برافورد ، معهد ويستار ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، على توفير خطوط الخلايا. نشكر الدكتورة لوريدانا سبويري على توفير صور الاستئصال بالتبريد C8161.
تم دعم هذا العمل من خلال منح المشاريع المقدمة إلى N.K.H.: مجلس البحوث الأسترالي (DP200100177) ومنحة مشروع Meehan (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |