Summary

Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Burada, antibiyotiğe dirençli bakterilerin sudan izolasyonu ve tanımlanması ve antibiyotik direnç genlerinin (ARG’ler) moleküler karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kültür temelli ve kültüre dayalı olmayan (metagenomik analiz) tekniklerin kullanımı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan’dan tatlı sularda bulunan farklı ARG’lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi sağlar.

Abstract

Tatlı su kütleleri ile ilişkili mikrobiyota yoluyla antibiyotik direncinin (AR) gelişimi ve yayılması önemli bir küresel sağlık sorunudur. Bu çalışmada, tatlı su örnekleri, hem geleneksel kültür temelli teknikler hem de yüksek verimli kültürden bağımsız metagenomik bir yaklaşım kullanılarak toplam bakteri çeşitliliği ve AR genleri (ARG’ler) açısından toplandı ve analiz edildi. Bu yazıda, tatlı su örneklerinden elde edilen toplam ve antibiyotiğe dirençli kültürlenebilir bakterilerin sayımı ve kültürlenebilir izolatlarda fenotipik ve genotipik direncin belirlenmesi için sistematik bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tatlı su örneğinden ekstrakte edilen toplam metagenomik DNA’nın tüm metagenomik analizinin, kültürlenemeyen bakteriler de dahil olmak üzere genel bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve su kütlesindeki toplam farklı ARG (rezistans)” havuzunun tanımlanması için kullanıldığını bildiriyoruz. Bu ayrıntılı protokolleri takiben, 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL aralığında yüksek antibiyotiğe dirençli bakteri yükü gözlemledik. Çoğu izolat, sefotaksim, ampisilin, levofloksasin, kloramfenikol, seftriakson, gentamisin, neomisin, trimetoprim ve siprofloksasin dahil olmak üzere çoklu test edilen antibiyotiklere dirençliydi ve çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksleri ≥0.2 idi ve izolatlarda yüksek direnç seviyelerini gösterdi. 16S rRNA dizilimi, Klebsiella pneumoniae gibi potansiyel insan patojenlerini ve Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. ve Aeromonas spp. gibi fırsatçı bakterileri tanımladı. İzolatların moleküler karakterizasyonu, blaTEM, blaCTX-M (β-laktamlar), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglikozitler) ve dfr1 (trimetoprimler) gibi çeşitli ARG’lerin varlığını gösterdi ve bu da tüm metagenomik DNA analizi ile doğrulandı. Metagenomik DNA’da antibiyotik efflux pompaları –mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaz-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol asetiltransferaz geni catB10 ve rifampisin direnç geni rphB- için kodlayan diğer ARG’lerin yüksek prevalansı da tespit edilmiştir. Bu çalışmada tartışılan protokollerin yardımıyla, çeşitli AR fenotipik ve genotipik özelliklere sahip su kaynaklı MAR bakterilerinin varlığını doğruladık. Bu nedenle, tüm metagenomik DNA analizi, bir su kütlesinin genel AR durumunu belirlemek için geleneksel kültür tabanlı tekniklere tamamlayıcı bir teknik olarak kullanılabilir.

Introduction

Antimikrobiyal direnç (AMR) en acil küresel sorunlardan biri olarak tanımlanmıştır. AMR’nin hızlı evrimi ve dünya çapında yayılması, bununla ilişkili sağlık maliyetleri açısından insan sağlığına ve küresel ekonomiye yönelik en büyük tehditlerden biridir1. Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı AR’de artışa neden olmuştur. Bu, COVID-19 pandemisi tarafından vurgulanmıştır; bu süre zarfında, birçok durumda, etkilenen hastalarda AMR nedeniyle ilişkili ikincil enfeksiyonların tedavisi büyük ölçüde tehlikeye girmiştir2. Antibiyotiklerin insanlar tarafından doğrudan kullanımı/yanlış kullanımının yanı sıra, tarım ve hayvancılıkta antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı ve su kütleleri de dahil olmak üzere çevreye uygunsuz şekilde deşarj edilmesi büyük bir endişe kaynağıdır3. Bakterilerde yeni direnç özelliklerinin ve çoklu ilaç direncinin artması, AR’nin gelişmesine ve yayılmasına yol açan faktörlerin daha iyi anlaşılması ihtiyacını acilen vurgulamaktadır. Plazmidler gibi mobil genetik elementler üzerinde sıklıkla çoklu AR genleri (ARG’ler) taşıyan çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, bu direnç genlerini potansiyel insan patojenleri de dahil olmak üzere dirençli olmayan mikroorganizmalara aktarabilir ve böylece son çare antibiyotiklerle bile tedavi edilemeyen süper böceklerin ortaya çıkmasına neden olabilir4. Bu çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, eğer su ekosistemlerinde mevcutsa, balık, yengeç ve yumuşakçalar gibi kontamine su bazlı gıdaların tüketimi yoluyla doğrudan insan bağırsağına girebilir. Önceki çalışmalar, AR bakterilerinin doğal olarak oluşan su sistemlerinde yayılmasının, içme suyu da dahil olmak üzere diğer su kaynaklarına da ulaşabileceğini ve böylece insan besin zincirine girebileceğini göstermiştir 5,6,7.

Bu çalışmanın amacı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan’daki bir su kütlesinde bulunan farklı ARG’lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi edinmek için kültür tabanlı ve kültür tabanlı olmayan (tüm metagenomik analiz) tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak kapsamlı bir protokol sağlamaktır. Geleneksel olarak, su kütlelerindeki bakteri çeşitliliğini incelemek için kültür temelli teknikler kullanılmıştır. Kültürlenebilir mikroorganizmalar, herhangi bir niş içindeki toplam mikrobiyotanın sadece küçük bir yüzdesini oluşturduğundan, bakteri çeşitliliğinin genel durumunu ve herhangi bir numunede yaygın olan çeşitli dirençli özellikleri daha iyi anlamak için, çeşitli kültür bazlı ve kültürden bağımsız teknikler birlikte kullanılmalıdır. Böyle sağlam ve güvenilir bir kültürden bağımsız teknik, tüm metagenomik DNA analizidir. Bu yüksek verimli yöntem, bakteri çeşitliliği veya çeşitliARG’lerin fonksiyonel ek açıklamaları 8,9 ile ilgili çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, metagenomu (bir numunedeki toplam genetik materyal) çeşitli analizler için başlangıç materyali olarak kullanır ve bu nedenle kültürden bağımsızdır. Bu çalışmadaki protokoller, su örneklerinde toplam bakteri çeşitliliği ve çeşitli ARG’ler (rezistom) hakkında bilgi edinmek için tüm metagenomik DNA analizi için kullanılabilir.

Protocol

1. Numune toplama ve işleme Örnek toplamaSu numunesinin uygun hacmini steril numune kaplarında toplayın ve kabın 3/4’ünden fazlasının doldurulmamasını sağlayın. Numuneleri toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede aseptik koşullar altında laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin. Numune işlemeHerhangi bir partikül maddeyi çıkarmak için su numunesini steril bir müslin bezden aseptik olarak filtreleyin. Daha…

Representative Results

Toplam bakteri yükü ve antibiyotiğe dirençli (AR) bakteri sayısıToplam bakteri yükünün sayımı, su örneklerinin 10−4 ila 10−6 kat seyreltilmesinin R2A Agar, Modifiye ortam üzerine yayılmasıyla gerçekleştirildi. AR bakteri sayısının sayımı için, antibiyotik içeren ortam plakalarına 10−3 ila 10−6 kat seyreltme yayıldı (Şekil 3). Toplam ve AR bakteri sayıları CFU / mL olarak hesaplandı ve tüm…

Discussion

Örneklem toplama ve işleme önemli bir rol oynar ve çalışmanın sonuçlarını ve yorumlanmasını etkileyebilir. Bu nedenle, numunelerdeki değişkenliği dışlamak için, incelenen tatlı su kütlesinin birden fazla yerinde örnekleme yapmak önemlidir. Bu tür numuneleri işlerken uygun aseptik çevre koşullarının korunması, kontaminasyonu önleyebilir. Ayrıca, ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesini ve miktarını etkileyebilecek bakteri bileşimindeki değişiklikleri önlemek için, transit koşul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Mumbai Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Bölümü-Üniversite Araştırma ve Bilimsel Mükemmellik Teşvik (DST-PURSE) Programından mali hibelerle desteklenmiştir. Devika Ghadigaonkar, program kapsamında Proje Üyesi olarak çalıştı. Bilim ve Teknoloji Bölümü-Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (DST-SERB) Proje no: CRG/2018/003624 kapsamında Kıdemli Araştırma Görevlisi Harshali Shinde tarafından sağlanan teknik yardım kabul edilmektedir.

Materials

100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA – Not Applicable

References

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

View Video