Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidos pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.
Abstract
O desenvolvimento e disseminação da resistência aos antibióticos (RA) através da microbiota associada a corpos de água doce é uma grande preocupação de saúde global. No presente estudo, amostras de água doce foram coletadas e analisadas com relação à diversidade bacteriana total e aos genes AR (ARGs) usando técnicas convencionais baseadas em cultura e uma abordagem metagenômica independente de cultura de alto rendimento. Este trabalho apresenta um protocolo sistemático para a enumeração das bactérias cultiváveis totais e resistentes a antibióticos de amostras de água doce e a determinação da resistência fenotípica e genotípica em isolados cultiváveis. Além disso, relatamos o uso de análise metagenômica completa do DNA metagenômico total extraído da amostra de água doce para a identificação da diversidade bacteriana geral, incluindo bactérias não cultiváveis, e a identificação do pool total de diferentes ARGs (resistoma) no corpo d’água. Seguindo esses protocolos detalhados, observamos uma alta carga bacteriana resistente a antibióticos na faixa de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/mL. A maioria dos isolados foi resistente aos múltiplos antibióticos testados, incluindo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima e ciprofloxacina, com múltiplos índices de resistência a antibióticos (MAR) de ≥0,2, indicando altos níveis de resistência nos isolados. O sequenciamento do RNAr 16S identificou potenciais patógenos humanos, como Klebsiella pneumoniae, e bactérias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. A caracterização molecular dos isolados mostrou a presença de vários ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactâmicos), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglicosídeos) e dfr1 (trimetoprims), o que também foi confirmado por toda a análise metagenômica de DNA. Uma alta prevalência de outros ARGs que codificam bombas de efluxo de antibióticos – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, o gene da cloranfenicol acetiltransferase catB10 e o gene de resistência à rifampicina rphB – também foi detectada no DNA metagenômico. Com a ajuda dos protocolos discutidos neste estudo, confirmamos a presença de bactérias MAR transmitidas pela água com diversas características fenotípicas e genotípicas da RA. Assim, a análise metagenômica completa do DNA pode ser usada como uma técnica complementar às técnicas convencionais baseadas em cultura para determinar o status geral de RA de um corpo d’água.
Introduction
A resistência antimicrobiana (RAM) tem sido identificada como um dos problemas globais mais prementes. A rápida evolução da RAM e a sua propagação mundial são uma das maiores ameaças à saúde humana e à economia global em termos dos custos de saúde que lhe estão associados1. O uso excessivo e indevido de antibióticos levaram a um aumento da RA. Isso foi destacado pela pandemia de COVID-19, durante a qual o tratamento de infecções secundárias associadas, em muitos casos, foi extremamente comprometido devido à RAM nos pacientes afetados2. Além do uso/uso indevido direto de antibióticos por seres humanos, o uso excessivo e indevido de antibióticos na agricultura e pecuária e sua descarga inadequada no meio ambiente, incluindo corpos d’água, são uma grande preocupação3. O surgimento de novas características de resistência e multirresistência em bactérias destaca urgentemente a necessidade de uma melhor compreensão dos fatores que levam ao desenvolvimento da RA e sua disseminação. Múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, que muitas vezes carregam múltiplos genes AR (ARGs) em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, podem transferir esses genes de resistência para microrganismos não resistentes, incluindo potenciais patógenos humanos, levando ao surgimento de superbactérias que são intratáveis mesmo com antibióticos de último recurso4. Essas múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, se presentes nos ecossistemas aquáticos, podem entrar diretamente no intestino humano através do consumo de alimentos contaminados à base de água, como peixes, caranguejos e moluscos. Estudos anteriores mostraram que a disseminação de bactérias RA em sistemas de água que ocorrem naturalmente também pode atingir outros suprimentos de água, incluindo água potável, e, assim, pode entrar na cadeia alimentar humana 5,6,7.
O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo abrangente usando uma combinação de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica completa) para obter informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em um corpo d’água em Mumbai, Índia. Convencionalmente, técnicas baseadas em cultura têm sido usadas para estudar a diversidade bacteriana em corpos d’água. Como os microrganismos cultiváveis constituem apenas uma pequena porcentagem da microbiota total em qualquer nicho, para ter uma melhor compreensão do status geral da diversidade bacteriana e das várias características resistentes prevalentes em qualquer amostra, várias técnicas baseadas em cultura e independentes da cultura devem ser usadas em conjunto. Uma dessas técnicas robustas e confiáveis independentes de cultura é a análise metagenômica completa do DNA. Esse método de alto rendimento tem sido utilizado com sucesso em diversos estudos sobre diversidade bacteriana ou anotações funcionais de vários ARGs 8,9. Esta técnica utiliza o metagenoma (o material genético total de uma amostra) como matéria-prima para várias análises e, por isso, é independente da cultura. Os protocolos do presente estudo podem ser utilizados para análise metagenômica completa de DNA para obtenção de informações sobre a diversidade bacteriana total e vários ARGs (resistoma) em amostras de água.
Protocol
Representative Results
Discussion
A coleta e o processamento da amostra desempenham um papel significativo e podem afetar os resultados e a interpretação do estudo. Assim, para descartar a variabilidade nas amostras, é importante realizar a amostragem em vários locais do corpo de água doce em estudo. Manter condições ambientais assépticas adequadas ao manusear essas amostras pode evitar a contaminação. Além disso, para evitar alterações na composição bacteriana que possam influenciar a qualidade e a quantidade de ácidos nucleicos extraíd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações financeiras do Departamento de Ciência e Tecnologia-Promoção da Pesquisa Universitária e Excelência Científica (DST-PURSE) Esquema da Universidade de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabalhou como bolsista do projeto sob o esquema. É reconhecida a ajuda técnica prestada por Harshali Shinde, investigador sénior do Departamento de Ciência e Tecnologia-Conselho de Investigação em Ciência e Engenharia (DST-SERB): CRG/2018/003624.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
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