水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価
Summary
ここでは、水からの抗生物質耐性菌の分離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子(ARG)の分子特性評価のための詳細なプロトコルを紹介します。培養ベースおよび非培養ベース(メタゲノム解析)技術の使用は、インドのムンバイからの淡水に存在する細菌の多様性全体とさまざまなARGの総プールに関する完全な情報を提供します。
Abstract
淡水域に関連する微生物叢を介した抗生物質耐性(AR)の発生と拡散は、世界的な健康上の大きな懸念事項です。本研究では、淡水サンプルを収集し、従来の培養ベースの技術とハイスループット培養に依存しないメタゲノムアプローチの両方を使用して、細菌の多様性とAR遺伝子(ARG)全体に関して分析しました。この論文は、淡水サンプルから総および抗生物質耐性の培養可能な細菌を列挙し、培養可能な分離株の表現型および遺伝子型耐性を決定するための体系的なプロトコルを提示します。さらに、淡水サンプルから抽出された全メタゲノムDNAの全メタゲノム解析を使用して、非培養細菌を含む全体的な細菌の多様性を特定し、水域内のさまざまなARG(レジストーム)の総プールを同定したことを報告します。これらの詳細なプロトコルに従って、9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mLの範囲で高い抗生物質耐性菌負荷が観察されました。ほとんどの分離株は、セフォタキシム、アンピシリン、レボフロキサシン、クロラムフェニコール、セフトリアキソン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、トリメトプリム、シプロフロキサシンなどの複数の試験済み抗生物質に耐性があり、複数の抗生物質耐性(MAR)指数は≥0.2であり、分離株の耐性が高いことを示しています。16S rRNAシーケンシングにより、肺炎桿菌などの潜在的なヒト病原体、およびコマモナス属、ミクロコッカス属、アルスロバクター属、アエロモナス属などの日和見細菌が特定されました。 分離株の分子特性評価は、blaTEM、blaCTX-M(β-ラクタム)、aadA、aac(6′)-Ib(アミノグリコシド)、およびdfr1(トリメトプリム)などのさまざまなARGの存在を示し、これもメタゲノムDNA分析全体で確認されました。抗生物質排出ポンプをコードする他のARGの高い有病率-mtrA、macB、mdtA、acrD、β-ラクタマーゼ-SMB-1、VIM-20、ccrA、ampC、blaZ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子catB10、およびリファンピシン耐性遺伝子rphB-もメタゲノムDNAで検出されました。この研究で議論されたプロトコルの助けを借りて、多様なAR表現型および遺伝子型形質を有する水系MAR細菌の存在を確認しました。したがって、全メタゲノムDNA分析は、水域の全体的なAR状態を決定するための従来の培養ベースの技術を補完する技術として使用できます。
Introduction
薬剤耐性(AMR)は、最も差し迫った地球規模の問題の1つとして認識されています。AMRの急速な進化とその世界的な普及は、それに関連する医療費の観点から、人間の健康と世界経済にとって最大の脅威の1つです1。抗生物質の過剰使用と誤用は、ARの増加につながっています。これはCOVID-19のパンデミックによって強調されており、その間、多くの場合、影響を受けた患者のAMRにより、関連する二次感染症の治療が大幅に損なわれました2。人間による抗生物質の直接使用/誤用に加えて、農業および畜産における抗生物質の過剰使用および誤用、および水域を含む環境への不適切な排出が大きな懸念事項です3。細菌における新しい耐性形質と多剤耐性の台頭は、ARの開発とその普及につながる要因のより良い理解の必要性を緊急に浮き彫りにしています。プラスミドなどの移動性遺伝要素に複数のAR遺伝子(ARG)を運ぶことが多い複数の抗生物質耐性菌は、これらの耐性遺伝子を潜在的なヒト病原体を含む非耐性微生物に移す可能性があるため、最後の手段の抗生物質でさえ治療できないスーパーバグの出現につながります4。これらの複数の抗生物質耐性菌は、水生態系に存在する場合、魚、カニ、軟体動物などの汚染された水ベースの食品を消費することにより、人間の腸に直接侵入する可能性があります。以前の研究では、天然に存在する水系におけるAR細菌の拡散は、飲料水を含む他の水供給にも到達する可能性があり、したがって、人間の食物連鎖に入る可能性があることが示されています5,6,7。
本研究の目的は、培養ベースと非培養ベースの組み合わせを使用した包括的なプロトコルを提供することです(全メタゲノム分析)技術 完全な情報を取得する インドのムンバイの水域に存在する細菌の多様性とさまざまなARGの総プール。従来、培養ベースの技術は、水域における細菌の多様性を研究するために使用されてきた。培養可能な微生物は、どのニッチでも微生物叢全体のごく一部しか構成していないため、細菌の多様性の全体的な状態と、あらゆるサンプルに蔓延しているさまざまな耐性形質をよりよく理解するには、さまざまな培養ベースおよび培養に依存しない技術を並行して使用する必要があります。そのような堅牢で信頼性の高い培養に依存しない技術の1つは、全メタゲノムDNA分析です。このハイスループットメソッドは、細菌の多様性やさまざまなARGの機能アノテーションに関するさまざまな研究で成功裏に利用されています8,9。この手法は、メタゲノム(サンプル中の総遺伝物質)をさまざまな分析の出発材料として使用するため、培養に依存しません。本研究のプロトコルは、全メタゲノムDNA分析に使用して、水サンプル中の細菌全体の多様性とさまざまなARG(レジストーム)に関する情報を取得できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
サンプルの収集と処理は重要な役割を果たし、研究の結果と解釈に影響を与える可能性があります。したがって、サンプルの変動性を排除するには、調査対象の淡水域の複数の場所でサンプリングを実行することが重要です。このようなサンプルを取り扱う際に適切な無菌環境条件を維持することで、汚染を防ぐことができます。さらに、抽出された核酸の質と量に影響を与える可能性のあ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、ムンバイ大学の科学技術省-大学研究および科学的卓越性促進(DST-PURSE)スキームからの財政的助成金によって部分的に支援されました。Devika Ghadigaonkarは、このスキームの下でプロジェクトフェローとして働いていました。科学技術省科学技術研究委員会(DST-SERB)プロジェクト番号:CRG/2018/003624の上級研究員であるHarshali Shindeによる技術的支援が認められています。
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
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