Summary

Выделение и идентификация бактерий, устойчивых к антибиотикам, передающихся через воду, и молекулярная характеристика их генов устойчивости к антибиотикам

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол выделения и идентификации устойчивых к антибиотикам бактерий из воды и молекулярную характеристику их генов устойчивости к антибиотикам (ARG). Использование методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (метагеномный анализ), дает полную информацию об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в пресных водах из Мумбаи, Индия.

Abstract

Развитие и распространение устойчивости к антибиотикам (АР) через микробиоту, связанную с пресноводными водоемами, является серьезной глобальной проблемой здравоохранения. В настоящем исследовании образцы пресной воды были собраны и проанализированы в отношении общего бактериального разнообразия и генов AR (ARG) с использованием как традиционных методов, основанных на культурах, так и метагеномного подхода, независимого от культуры. В данной работе представлен систематический протокол перечисления общих и устойчивых к антибиотикам культивируемых бактерий из образцов пресной воды и определения фенотипической и генотипической резистентности в культивируемых изолятах. Кроме того, мы сообщаем об использовании полного метагеномного анализа общей метагеномной ДНК, извлеченной из образца пресной воды, для идентификации общего бактериального разнообразия, включая некультивируемые бактерии, и идентификации общего пула различных ARG (резистома) в водном объекте. Следуя этим подробным протоколам, мы наблюдали высокую устойчивую к антибиотикам бактериальную нагрузку в диапазоне 9,6 × 10 5-1,2 × 109 КОЕ/мл. Большинство изолятов были устойчивы к множественным протестированным антибиотикам, включая цефотаксим, ампициллин, левофлоксацин, хлорамфеникол, цефтриаксон, гентамицин, неомицин, триметоприм и ципрофлоксацин, с индексами множественной устойчивости к антибиотикам (MAR) ≥0,2, что указывает на высокие уровни резистентности в изолятах. Секвенирование 16S рРНК выявило потенциальные патогены человека, такие как Klebsiella pneumoniae, и оппортунистические бактерии, такие как Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. и Aeromonas spp. Молекулярная характеристика изолятов показала наличие различных ARG, таких как blaTEM, blaCTX-M (β-лактамы), aadA, aac (6′)-Ib (аминогликозиды) и dfr1 (триметопримы), что также было подтверждено всем метагеномным анализом ДНК. В метагеномной ДНК также была обнаружена высокая распространенность других АРГ, кодирующих для насосов оттока антибиотиков – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, гена хлорамфениколацетилтрансферазы catB10 и гена устойчивости к рифампицину rphB-. С помощью протоколов, обсуждаемых в этом исследовании, мы подтвердили наличие передаваемых через воду бактерий MAR с различными фенотипическими и генотипическими признаками AR. Таким образом, весь метагеномный анализ ДНК может быть использован в качестве дополнительного метода к традиционным методам, основанным на культурах, для определения общего статуса AR водного объекта.

Introduction

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) была определена в качестве одной из наиболее актуальных глобальных проблем. Быстрая эволюция УПП и его распространение во всем мире являются одной из самых больших угроз здоровью человека и мировой экономике с точки зрения связанных с ним расходов наздравоохранение1. Чрезмерное и неправильное использование антибиотиков привело к увеличению AR. Это было подчеркнуто пандемией COVID-19, во время которой лечение ассоциированных вторичных инфекций во многих случаях было чрезвычайно скомпрометировано из-за УПП у пострадавших пациентов2. Помимо прямого использования/неправильного использования антибиотиков людьми, серьезнойпроблемой является чрезмерное и неправильное использование антибиотиков в сельском хозяйстве и животноводстве и их ненадлежащий сброс в окружающую среду, включая водные объекты3. Появление новых признаков резистентности и множественной лекарственной устойчивости у бактерий настоятельно подчеркивает необходимость лучшего понимания факторов, ведущих к развитию АР и его распространению. Множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, которые часто несут несколько генов AR (ARG) на мобильных генетических элементах, таких как плазмиды, могут передавать эти гены устойчивости нерезистентным микроорганизмам, включая потенциальные патогены человека, что приводит к появлению супербактерий, которые не поддаются лечению даже антибиотиками последней инстанции4. Эти множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, если они присутствуют в водных экосистемах, могут непосредственно проникать в кишечник человека через потребление загрязненных продуктов на водной основе, таких как рыба, крабы и моллюски. Предыдущие исследования показали, что распространение бактерий AR в естественных водных системах может также достигать других источников воды, включая питьевую воду, и, таким образом, может попасть в пищевую цепь человека 5,6,7.

Целью настоящего исследования является предоставление всеобъемлющего протокола с использованием комбинации методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (весь метагеномный анализ), для получения полной информации об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в водном объекте в Мумбаи, Индия. Традиционно для изучения бактериального разнообразия в водоемах используются методы, основанные на культурах. Поскольку культивируемые микроорганизмы составляют лишь небольшой процент от общей микробиоты в любой нише, чтобы лучше понять общее состояние бактериального разнообразия и различные устойчивые признаки, преобладающие в любом образце, необходимо использовать различные методы, основанные на культуре и независимые от культуры методы. Одним из таких надежных и надежных методов, не зависящих от культуры, является анализ всей метагеномной ДНК. Этот высокопроизводительный метод был успешно использован в различных исследованиях бактериального разнообразия или функциональных аннотаций различных ARG 8,9. Этот метод использует метагеном (общий генетический материал в образце) в качестве исходного материала для различных анализов и, следовательно, не зависит от культуры. Протоколы в настоящем исследовании могут быть использованы для анализа всей метагеномной ДНК для получения информации об общем бактериальном разнообразии и различных ARG (резистоме) в образцах воды.

Protocol

1. Сбор и обработка образцов Сбор образцовСоберите соответствующий объем пробы воды в стерильный контейнер (контейнеры) для проб, обеспечив заполнение не более 3/4 контейнера. Транспортируйте образцы в лабораторию в асептических условиях как можно скорее после ?…

Representative Results

Общая бактериальная нагрузка и количество устойчивых к антибиотикам (AR) бактерийПеречисление общей бактериальной нагрузки проводилось путем распределения 10−4-10−6-кратных разбавлений проб воды на R2A Agar, модифицированной среде. Для перечисления количества бакте…

Discussion

Сбор и обработка образцов играют важную роль и могут повлиять на результаты и интерпретацию исследования. Следовательно, чтобы исключить изменчивость проб, важно проводить отбор проб в нескольких местах исследуемого пресноводного водоема. Поддержание надлежащих асептических услови?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана финансовыми грантами Департамента науки и техники – Содействие университетским исследованиям и научному совершенству (DST-PURSE) Схемы Университета Мумбаи. Девика Гадигаонкар работала в качестве стипендиата проекта по этой схеме. Техническая помощь, предоставленная Харшали Шинде, старшим научным сотрудником Департамента науки и техники, науки и инженерных исследований (DST-SERB) Проект No: CRG/2018/003624, приветствуется.

Materials

100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA – Not Applicable

References

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

View Video