Характеристика механических свойств первичной клеточной стенки в органах живых растений с помощью атомно-силовой микроскопии
Summary
Исследования биомеханики клеточных стенок необходимы для понимания роста и морфогенеза растений. Следующий протокол предлагается исследовать тонкие первичные клеточные стенки во внутренних тканях молодых органов растений с помощью атомно-силовой микроскопии.
Abstract
Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток и, следовательно, будущие размеры и форму растения. Для измерения этих свойств было разработано много сложных методов; однако атомно-силовая микроскопия (АСМ) остается наиболее удобной для изучения упругости клеточной стенки на клеточном уровне. Одним из наиболее важных ограничений этого метода было то, что только поверхностные или изолированные живые клетки могут быть изучены. Здесь представлено использование атомно-силовой микроскопии для исследования механических свойств первичных клеточных стенок, принадлежащих внутренним тканям растительного тела. Этот протокол описывает измерения кажущегося модуля Юнга клеточных стенок в корнях, но метод также может быть применен к другим органам растений. Измерения проводятся на вибратомных участках растительного материала в жидкой клетке, что позволяет (i) избежать использования плазмолизирующих растворов или пропитки образца воском или смолой, (ii) сделать эксперименты быстрыми и (iii) предотвратить обезвоживание образца. Как антиклинальные, так и периклинальные клеточные стенки могут быть изучены, в зависимости от того, как образец был разделен. Различия в механических свойствах разных тканей могут быть исследованы в одном срезе. В протоколе описаны принципы планирования исследования, вопросы подготовки образцов и измерений, а также метод выбора силовых деформационных кривых во избежание влияния топографии на полученные значения модуля упругости. Метод не ограничен размером выборки, но чувствителен к размеру клеток (т.е. клетки с большим просветом трудно исследовать).
Introduction
Механические свойства клеточной стенки растения определяют форму клетки и ее способность расти. Например, растущий кончик пыльцевой трубки мягче, чем нерастающие части той же трубки1. Образованию примордий на меристеме Arabidopsis предшествует локальное снижение жесткости клеточной стенки на месте будущего примордия 2,3. Клеточные стенки Arabidopsis hypocotyl, которые параллельны основной оси роста и растут быстрее, мягче, чем те, которые перпендикулярны этой оси и растут медленнее 4,5. У корня кукурузы переход клеток от деления к удлинению сопровождался снижением модулей упругости во всех тканях корня. Модули оставались низкими в зоне удлинения и увеличивались в зоне позднего удлинения6.
Несмотря на наличие различных методов, большие массивы биохимической и генетической информации по биологии клеточных стенок, получаемые ежегодно, редко сравниваются с механическими свойствами клеточных стенок. Например, мутанты на генах, связанных с клеточной стенкой, часто имеют измененный рост и развитие 4,7,8, но редко описываются в терминах биомеханики. Одной из причин этого является сложность проведения измерений на клеточном и субклеточном уровнях. Атомно-силовая микроскопия (AFM) в настоящее время является основным подходом для таких анализов9.
В последние годы были проведены многочисленные исследования биомеханики клеточной стенки растений на основе AFM. Исследованы механические свойства клеточных стенок наружных тканей Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 и лука12, а также культивируемых клеток 13,14,15. Однако поверхностные клетки растения могут иметь клеточные стенки, механические свойства которых отличаются от механических свойств внутренних тканей6. Кроме того, растительные клетки находятся под давлением тургора, что делает их более жесткими. Чтобы избавиться от влияния тургорного давления, исследователям приходится использовать плазмолизирующие растворы 2,3,4,5,10,11 или разлагать полученные значения на тургор и вклады клеточной стенки12. Первый подход приводит к обезвоживанию образца и изменяет толщину и свойства клеточной стенки16, в то время как второй подход требует дополнительных измерений и сложной математики и применяется только к клеткам относительно простой формы12. Свойства клеточных стенок внутренних тканей могут быть оценены на криосекции17 или участках растительного материала, пропитанных смолой8. Однако оба метода предполагают обезвоживание и/или пропитку образцов, что неизбежно приводит к изменению свойств. Свойства изолированных или культивируемых клеток трудно соотнести с физиологией всего растения. Как культивирование, так и изоляция растительных клеток могут влиять на механические свойства их клеточных стенок.
Представленный здесь метод дополняет вышеупомянутые подходы. С его помощью можно исследовать первичные клеточные стенки любой ткани и на любой стадии развития растений. Секционирование и наблюдения AFM проводились в жидкости, что позволяет избежать обезвоживания образца. Проблема тургора была решена по мере разрезания клеток. Протокол описывает работу с корнями кукурузы и ржи, но любой другой образец может быть исследован, если он подходит для вибратомного сечения.
Описанные здесь исследования AFM были выполнены с использованием метода силы-объема. Различные инструменты используют разные названия для этого метода. Однако основной принцип тот же; карта силы-объема образца получается синусоидальным или треугольным движением консольного аппарата (или образца) для достижения определенной силы нагрузки в каждой анализируемой точке при регистрации консольного отклонения18. Результат объединяет топографическое изображение поверхности и массив кривых силы-расстояния. Каждая кривая используется для расчета деформации, жесткости, модуля Юнга, адгезии и рассеивания энергии в определенной точке. Аналогичные данные могут быть получены путем точечной силовой спектроскопии после сканирования в контактном режиме19, хотя это более трудоемко.
Protocol
Representative Results
Discussion
Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток, а значит, будущие размеры и форму растения. Метод на основе AFM, представленный здесь, дополняет существующие методы, которые используются для изучения свойств клеточных стен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дмитрия Суслова (Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия) и профессора Миру Пономареву (Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, ФИЦ КАЗНЦ РАН, Казань, Россия) за предоставление семян кукурузы и ржи соответственно. Представленный метод разработан в рамках проекта Российского научного фонда No 18-14-00168, присужденного ЛК. Часть работ (получение представленных результатов) была выполнена АП при финансовой поддержке государственного задания для ФИЦ «Казанский научный центр РАН».
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
