Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica
Summary
Gli studi sulla biomeccanica della parete cellulare sono essenziali per comprendere la crescita e la morfogenesi delle piante. Il seguente protocollo è proposto per studiare le pareti cellulari primarie sottili nei tessuti interni di giovani organi vegetali utilizzando la microscopia a forza atomica.
Abstract
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e, quindi, le dimensioni e la forma future della pianta. Molte tecniche sofisticate sono state sviluppate per misurare queste proprietà; tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) rimane la più conveniente per studiare l’elasticità della parete cellulare a livello cellulare. Uno dei limiti più importanti di questa tecnica è stato che solo le cellule viventi superficiali o isolate possono essere studiate. Qui viene presentato l’uso della microscopia a forza atomica per studiare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie appartenenti ai tessuti interni di un corpo vegetale. Questo protocollo descrive le misurazioni dell’apparente modulo di Young delle pareti cellulari nelle radici, ma il metodo può essere applicato anche ad altri organi vegetali. Le misure vengono eseguite su sezioni derivate dal vibratomo di materiale vegetale in una cella liquida, il che consente (i) di evitare l’uso di soluzioni plasmolizzanti o l’impregnazione del campione con cera o resina, (ii) di rendere gli esperimenti veloci e (iii) di prevenire la disidratazione del campione. Sia le pareti cellulari anticlinale che periclinale possono essere studiate, a seconda di come il campione è stato sezionato. Le differenze nelle proprietà meccaniche dei diversi tessuti possono essere studiate in una singola sezione. Il protocollo descrive i principi della pianificazione dello studio, i problemi con la preparazione e le misurazioni dei campioni, nonché il metodo di selezione delle curve di forza-deformazione per evitare l’influenza della topografia sui valori ottenuti del modulo elastico. Il metodo non è limitato dalla dimensione del campione, ma è sensibile alle dimensioni delle celle (cioè, le cellule con un grande lume sono difficili da esaminare).
Introduction
Le proprietà meccaniche della parete cellulare della pianta determinano la forma della cellula e la sua capacità di crescere. Ad esempio, la punta crescente del tubo pollinico è più morbida delle parti non in crescita dello stesso tubo1. La formazione dei primordi sul meristema di Arabidopsis è preceduta da una diminuzione locale della rigidità della parete cellulare nel sito del futuro primordio 2,3. Le pareti cellulari di Arabidopsis hypocotyl, che sono parallele all’asse di crescita principale e crescono più velocemente, sono più morbide di quelle che sono perpendicolari a questo asse e crescono più lentamente 4,5. Nella radice di mais, la transizione delle cellule dalla divisione all’allungamento è stata accompagnata da una diminuzione dei moduli elastici in tutti i tessuti della radice. I moduli sono rimasti bassi nella zona di allungamento e sono aumentati nella zona di allungamento tardivo6.
Nonostante la disponibilità di vari metodi, le grandi matrici di informazioni biochimiche e genetiche sulla biologia della parete cellulare ottenute annualmente sono raramente confrontate con le proprietà meccaniche delle pareti cellulari. Ad esempio, i mutanti sui geni correlati alla parete cellulare hanno spesso una crescita e uno sviluppo alterati 4,7,8, ma sono raramente descritti in termini di biomeccanica. Una delle ragioni di ciò è la difficoltà di condurre misurazioni a livello cellulare e subcellulare. La microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente l’approccio principale per tali analisi9.
Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi basati sull’AFM sulla biomeccanica della parete cellulare vegetale. Sono state studiate le proprietà meccaniche delle pareti cellulari dei tessuti esterni di Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cipolla 12, nonché delle cellule in coltura 13,14,15. Tuttavia, le cellule superficiali di una pianta possono avere pareti cellulari le cui proprietà meccaniche differiscono da quelle dei tessuti interni6. Inoltre, le cellule vegetali sono pressurizzate dal turgore che le rende più rigide. Per eliminare l’influenza della pressione del turgore, i ricercatori devono utilizzare soluzioni plasmolizzanti 2,3,4,5,10,11 o decomporre i valori ottenuti in turgore e contributi della parete cellulare 12. Il primo approccio porta alla disidratazione del campione e modifica lo spessore e le proprietà della parete cellulare16, mentre il secondo approccio richiede ulteriori misurazioni e matematica complicata e si applica solo a cellule di forma relativamente semplice12. Le proprietà della parete cellulare dei tessuti interni possono essere valutate su criosezioni17 o sezioni di materiale vegetale impregnato di resina8. Tuttavia, entrambi i metodi comportano la disidratazione e / o l’impregnazione dei campioni, che porta inevitabilmente a cambiamenti nelle proprietà. Le proprietà delle cellule isolate o in coltura sono difficili da mettere in relazione con la fisiologia dell’intera pianta. Sia la coltivazione che l’isolamento delle cellule vegetali possono influenzare le proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari.
Il metodo qui presentato integra gli approcci sopra menzionati. Usandolo, è possibile esaminare le pareti cellulari primarie di qualsiasi tessuto e in qualsiasi fase dello sviluppo delle piante. Le osservazioni di sezionamento e AFM sono state eseguite in liquido che evita la disidratazione del campione. Il problema del turgore è stato risolto quando le cellule vengono tagliate. Il protocollo descrive il lavoro con le radici di mais e segale, ma qualsiasi altro campione può essere esaminato se è adatto per il sezionamento del vibratomo.
Gli studi AFM qui descritti sono stati eseguiti utilizzando la tecnica forza-volume. Strumenti diversi usano nomi diversi per questo metodo. Tuttavia, il principio di base è lo stesso; Una mappa forza-volume del campione è ottenuta da un movimento sinusoidale o triangolare del cantilever (o campione) per ottenere una certa forza di carico in ogni punto analizzato, registrando la deflessione a sbalzo18. Il risultato combina un’immagine topografica della superficie e la serie di curve forza-distanza. Ogni curva viene utilizzata per calcolare la deformazione, la rigidità, il modulo di Young, l’adesione e la dissipazione di energia in un punto specifico. Dati simili possono essere ottenuti mediante spettroscopia di forza punto per punto dopo la scansione in modalità di contatto19, sebbene richieda più tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e quindi le dimensioni e la forma future della pianta. Il metodo basato sull’AFM qui presentato integra le tecniche esistenti utilizzate per studiare le proprietà delle pareti cellulari delle piante. Permette di studiare l’elasticità delle pareti cellulari, che appartengono ai tessuti interni della pianta. Utilizzando il metodo presentato, sono state mappate le proprietà meccaniche delle pare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Dmitry Suslov (Università statale di San Pietroburgo, San Pietroburgo, Russia) e la Prof.ssa Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russia) per aver fornito semi di mais e segale, rispettivamente. Il metodo presentato è stato sviluppato nell’ambito del progetto della Fondazione scientifica russa n. 18-14-00168 assegnato a LK. La parte del lavoro (ottenimento dei risultati presentati) è stata eseguita da AP con il sostegno finanziario dell’incarico governativo per il FRC Kazan Scientific Center di RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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