Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica
Summary
Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.
Abstract
As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. Muitas técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para medir essas propriedades; no entanto, a microscopia de força atômica (AFM) continua sendo a mais conveniente para estudar a elasticidade da parede celular no nível celular. Uma das limitações mais importantes desta técnica tem sido que apenas células vivas superficiais ou isoladas podem ser estudadas. Aqui, o uso da microscopia de força atômica para investigar as propriedades mecânicas das paredes celulares primárias pertencentes aos tecidos internos de um corpo vegetal é apresentado. Este protocolo descreve medidas do módulo aparente de Young de paredes celulares em raízes, mas o método também pode ser aplicado a outros órgãos vegetais. As medições são realizadas em seções de material vegetal derivadas de vibratomo em uma célula líquida, o que permite (i) evitar o uso de soluções plasmolizantes ou impregnação de amostras com cera ou resina, (ii) tornar os experimentos rápidos e (iii) prevenir a desidratação da amostra. Ambas as paredes celulares anticlinais e periclinais podem ser estudadas, dependendo de como a amostra foi seccionada. Diferenças nas propriedades mecânicas de diferentes tecidos podem ser investigadas em uma única seção. O protocolo descreve os princípios de planejamento do estudo, questões com a preparação e medidas do espécime, bem como o método de seleção de curvas de força-deformação para evitar a influência da topografia nos valores obtidos do módulo elástico. O método não é limitado pelo tamanho da amostra, mas é sensível ao tamanho da célula (ou seja, células com um grande lúmen são difíceis de examinar).
Introduction
As propriedades mecânicas da parede celular da planta determinam a forma da célula e sua capacidade de crescer. Por exemplo, a ponta de crescimento do tubo de pólen é mais macia do que as partes não crescentes do mesmo tubo1. A formação de primórdios no meristema Arabidopsis é precedida por uma diminuição local da rigidez da parede celular no local do futuro primordium 2,3. As paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que são paralelas ao eixo principal de crescimento e crescem mais rapidamente, são mais macias do que aquelas que são perpendiculares a este eixo e crescem mais lentamente 4,5. Na raiz do milho, a transição das células da divisão para o alongamento foi acompanhada por uma diminuição dos módulos elásticos em todos os tecidos da raiz. Os módulos permaneceram baixos na zona de alongamento e aumentaram na zona de alongamento tardio6.
Apesar da disponibilidade de vários métodos, as grandes matrizes de informações bioquímicas e genéticas sobre a biologia da parede celular obtidas anualmente raramente são comparadas com as propriedades mecânicas das paredes celulares. Por exemplo, mutantes em genes relacionados à parede celular frequentemente têm crescimento e desenvolvimento alterados 4,7,8, mas raramente são descritos em termos de biomecânica. Uma das razões para isso é a dificuldade de realizar medições nos níveis celular e subcelular. A microscopia de força atômica (AFM) é atualmente a principal abordagem para tais análises9.
Nos últimos anos, numerosos estudos baseados em AFM sobre biomecânica da parede celular vegetal foram realizados. As propriedades mecânicas das paredes celulares dos tecidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cebola 12, bem como de células cultivadas 13,14,15, têm sido investigadas. No entanto, as células superficiais de uma planta podem ter paredes celulares cujas propriedades mecânicas diferem das dos tecidos internos6. Além disso, as células vegetais são pressurizadas por turgor, o que as torna mais rígidas. Para se livrar da influência da pressão de turgor, os pesquisadores têm que utilizar soluções plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 ou decompor os valores obtidos em aportes de turgor e parede celular 12. A primeira abordagem leva à desidratação da amostra e altera a espessura e as propriedades da parede celular16, enquanto a segunda abordagem requer medidas adicionais e matemática complicada, e se aplica apenas a células de forma relativamente simples12. As propriedades da parede celular dos tecidos internos podem ser avaliadas em criosecções17 ou seções de material vegetal impregnado com resina8. No entanto, ambos os métodos envolvem desidratação e / ou impregnação de amostras, o que inevitavelmente leva a mudanças nas propriedades. As propriedades de células isoladas ou cultivadas são difíceis de relacionar com a fisiologia de toda a planta. Tanto o cultivo quanto o isolamento de células vegetais podem afetar as propriedades mecânicas de suas paredes celulares.
O método aqui apresentado complementa as abordagens supracitadas. Usando ele, as paredes celulares primárias de qualquer tecido e em qualquer estágio do desenvolvimento da planta podem ser examinadas. As observações de seccionamento e AFM foram realizadas em líquido, o que evita a desidratação da amostra. O problema do turgor foi resolvido à medida que as células são cortadas. O protocolo descreve o trabalho com raízes de milho e centeio, mas qualquer outra amostra pode ser examinada se for adequada para o corte de vibratome.
Os estudos de AFM aqui descritos foram realizados utilizando-se a técnica força-volume. Diferentes instrumentos usam nomes diferentes para este método. No entanto, o princípio básico é o mesmo; um mapa força-volume da amostra é obtido por um movimento sinusoidal ou triangular do cantilever (ou amostra) para atingir uma certa força de carga em cada ponto analisado, enquanto se registra a deflexão do cantilever18. O resultado combina uma imagem topográfica da superfície e a matriz de curvas força-distância. Cada curva é usada para calcular a deformação, rigidez, módulo de Young, adesão e dissipação de energia em um ponto específico. Dados semelhantes podem ser obtidos por espectroscopia de força ponto a ponto após a varredura no modode contato 19, embora seja mais demorado.
Protocol
Representative Results
Discussion
As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. O método baseado em AFM aqui apresentado complementa as técnicas existentes que são usadas para estudar as propriedades das paredes celulares das plantas. Permite que a elasticidade das paredes celulares, que pertencem aos tecidos internos da planta, seja investigada. Utilizando o método apresentado, as propriedades mecânicas das paredes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dmitry Suslov (Universidade Estatal de São Petersburgo, São Petersburgo, Rússia) e à Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Pesquisa Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazan, Rússia) pelo fornecimento de sementes de milho e centeio, respectivamente. O método apresentado foi desenvolvido no âmbito do Projeto da Fundação Científica Russa No. 18-14-00168 concedido à LK. A parte do trabalho (obtenção dos resultados apresentados) foi realizada pela AP com o apoio financeiro da atribuição do governo para o Centro Científico FRC Kazan da RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
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