Karakteriseren van mechanische eigenschappen van primaire celwand in levende plantenorganen met behulp van atoomkrachtmicroscopie
Summary
Studies van celwandbiomechanica zijn essentieel voor het begrijpen van plantengroei en morfogenese. Het volgende protocol wordt voorgesteld om dunne primaire celwanden in de interne weefsels van jonge plantenorganen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie.
Abstract
De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. Er zijn veel geavanceerde technieken ontwikkeld om deze eigenschappen te meten; atoomkrachtmicroscopie (AFM) blijft echter het handigst voor het bestuderen van celwandelasticiteit op cellulair niveau. Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat alleen oppervlakkige of geïsoleerde levende cellen kunnen worden bestudeerd. Hier wordt het gebruik van atoomkrachtmicroscopie gepresenteerd om de mechanische eigenschappen van primaire celwanden te onderzoeken die behoren tot de interne weefsels van een plantenlichaam. Dit protocol beschrijft metingen van de schijnbare Young’s modulus van celwanden in wortels, maar de methode kan ook worden toegepast op andere plantenorganen. De metingen worden uitgevoerd op van vibratomen afgeleide delen van plantaardig materiaal in een vloeibare cel, waardoor (i) het gebruik van plasmolyserende oplossingen of monsterimpregnatie met was of hars kan worden vermeden, (ii) de experimenten snel kunnen worden gemaakt en (iii) uitdroging van het monster kan worden voorkomen. Zowel anticlinale als periclinale celwanden kunnen worden bestudeerd, afhankelijk van hoe het monster werd gesneden. Verschillen in de mechanische eigenschappen van verschillende weefsels kunnen in één sectie worden onderzocht. Het protocol beschrijft de principes van studieplanning, problemen met specimenvoorbereiding en metingen, evenals de methode voor het selecteren van kracht-vervormingscurven om de invloed van topografie op de verkregen waarden van elastische modulus te voorkomen. De methode is niet beperkt door de steekproefgrootte, maar is gevoelig voor de celgrootte (d.w.z. cellen met een groot lumen zijn moeilijk te onderzoeken).
Introduction
De mechanische eigenschappen van de celwand van de plant bepalen de vorm van de cel en het vermogen om te groeien. Zo is de groeipunt van de stuifmeelbuis zachter dan de niet-groeiende delen van dezelfde buis1. De primordiavorming op Arabidopsis meristeem wordt voorafgegaan door een lokale afname van de celwandstijfheid op de plaats van het toekomstige primordium 2,3. De celwanden van Arabidopsis hypocotyl, die parallel lopen aan de hoofdgroeias en sneller groeien, zijn zachter dan die loodrecht op deze as en groeien langzamer 4,5. In de maïswortel ging de overgang van cellen van deling naar rek gepaard met een afname van elastische moduli in alle weefsels van de wortel. De moduli bleef laag in de rekzone en nam toe in de late rekzone6.
Ondanks de beschikbaarheid van verschillende methoden, worden de grote reeksen biochemische en genetische informatie over celwandbiologie die jaarlijks wordt verkregen, zelden vergeleken met de mechanische eigenschappen van celwanden. Mutanten op celwandgerelateerde genen hebben bijvoorbeeld vaak een veranderde groei en ontwikkeling 4,7,8, maar worden zelden beschreven in termen van biomechanica. Een van de redenen hiervoor is de moeilijkheid om metingen uit te voeren op cellulair en subcellulair niveau. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is momenteel de primaire benadering voor dergelijke analyses9.
In de afgelopen jaren zijn tal van AFM-gebaseerde studies naar biomechanica van plantencellen uitgevoerd. De mechanische eigenschappen van celwanden van de buitenste weefsels van Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 en ui12, evenals van gekweekte cellen 13,14,15, zijn onderzocht. De oppervlakkige cellen van een plant kunnen echter celwanden hebben waarvan de mechanische eigenschappen verschillen van die van de binnenste weefsels6. Bovendien worden plantencellen onder druk gezet door turgor waardoor ze stijver worden. Om zich te ontdoen van de invloed van turgordruk, moeten onderzoekers plasmolyserende oplossingen 2,3,4,5,10,11 gebruiken of de verkregen waarden ontleden in turgor- en celwandbijdragen12. De eerste benadering leidt tot uitdroging van monsters en verandert de dikte en eigenschappen van de celwand16, terwijl de tweede benadering aanvullende metingen en gecompliceerde wiskunde vereist en alleen van toepassing is op cellen van relatief eenvoudige vorm12. De celwandeigenschappen van inwendige weefsels kunnen worden geëvalueerd op cryosecties17 of delen van plantaardig materiaal geïmpregneerd met hars8. Beide methoden omvatten echter uitdroging en /of impregnatie van monsters, wat onvermijdelijk leidt tot veranderingen in eigenschappen. De eigenschappen van geïsoleerde of gekweekte cellen zijn moeilijk te relateren aan de fysiologie van de hele plant. Zowel de teelt als de isolatie van plantencellen kunnen de mechanische eigenschappen van hun celwanden beïnvloeden.
De hier gepresenteerde methode vormt een aanvulling op de bovengenoemde benaderingen. Hiermee kunnen de primaire celwanden van elk weefsel en in elk stadium van de ontwikkeling van de plant worden onderzocht. Sectie- en AFM-observaties werden uitgevoerd in vloeistof die uitdroging van monsters voorkomt. Het probleem van turgor werd opgelost toen de cellen worden gesneden. Het protocol beschrijft het werk met maïs- en roggewortels, maar elk ander monster kan worden onderzocht of het geschikt is voor vibratomsectie.
De hier beschreven AFM-onderzoeken zijn uitgevoerd met behulp van de kracht-volumetechniek. Verschillende instrumenten gebruiken verschillende namen voor deze methode. Het basisprincipe is echter hetzelfde; een kracht-volumekaart van het monster wordt verkregen door een sinusvormige of driehoekige beweging van de cantilever (of het monster) om een bepaalde belastingskracht op elk geanalyseerd punt te bereiken, terwijl de cantileverafbuigingwordt geregistreerd 18. Het resultaat combineert een topografisch beeld van het oppervlak en de reeks kracht-afstandscurven. Elke curve wordt gebruikt om de vervorming, stijfheid, Young’s modulus, adhesie en energiedissipatie op een specifiek punt te berekenen. Vergelijkbare gegevens kunnen worden verkregen door punt-voor-punt krachtspectroscopie na het scannen in contactmodus19, hoewel het tijdrovender is.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen, en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. De hier gepresenteerde AFM-gebaseerde methode is een aanvulling op bestaande technieken die worden gebruikt om de eigenschappen van plantencelwanden te bestuderen. Hiermee kan de elasticiteit van celwanden, die behoren tot de binnenste weefsels van de plant, worden onderzocht. Met behulp van de gepresenteerde methode werden de mechanische eigenschappen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen dr. Dmitry Suslov (Sint-Petersburg Staatsuniversiteit, Sint-Petersburg, Rusland) en prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusland) bedanken voor het leveren van respectievelijk maïs- en roggezaden. De gepresenteerde methode is ontwikkeld in het kader van het Russian Science Foundation Project No. 18-14-00168 toegekend aan LK. Het deel van het werk (het verkrijgen van de gepresenteerde resultaten) werd uitgevoerd door AP met de financiële steun van de overheidsopdracht voor het FRC Kazan Scientific Center van RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
