Bu makalenin amacı, KitV558Δ/+ fare modelini ve fare örneklerinin başarılı diseksiyonu ve işlenmesi için teknikleri tanımlamaktır.
Gastrointestinal stromal tümör (GİST) en sık görülen insan sarkomudur ve tipik olarak KIT reseptöründeki tek bir mutasyon tarafından yönlendirilir. Tümör tipleri arasında, yeni nesil kanser tedavilerini araştırmak için çok sayıda fare modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, GİST’te, çoğu in vivo çalışma, doğal sınırlamaları olan ksenograft fare modellerini kullanır. Burada, bir KitV558Δ / + mutasyonu barındıran gastrointestinal stromal tümörün immün yetkinliği, genetiği değiştirilmiş bir fare modelini tanımladık. Bu modelde, çoğu GİST’den sorumlu onkogen olan mutant KIT, insan GIST’lerinde görülen histolojik görünümü ve immün infiltrasyonu taklit eden bir GIST’e yol açan endojen promotörü tarafından yönlendirilir. Ayrıca, bu model hem hedefe yönelik moleküler hem de immün tedavileri araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Burada, bir KitV558Δ/+ fare kolonisinin ıslahını ve bakımını açıklıyoruz. Ek olarak, bu yazıda GİST’in tedavisi ve tedariki, KitV558Δ/+ farelerde mezenterik lenf nodu drenajı ve bitişik çekumun yanı sıra moleküler ve immünolojik analizler için numune hazırlama ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
GİST, Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 6.000 vaka insidansı olan insanlarda en yaygın sarkomdur1. GIST, Cajal’ın interstisyel hücreleri olarak adlandırılan gastrointestinal kalp pili hücrelerinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir ve tipik olarak tirozin kinaz kiti veya PDGFRA2’deki tek bir mutasyon tarafından tahrik edilmektedir. Cerrahi, GİST tedavisinin temelini oluşturur ve iyileştirici olabilir, ancak ilerlemiş hastalığı olan hastalar tirozin kinaz inhibitörü (TKI), imatinib ile tedavi edilebilir. İmatinib, 20 yılı aşkın bir süre önce kullanılmaya başlanmasından bu yana, GİST’teki tedavi paradigmasını dönüştürmüş ve ileri evre hastalıklarda sağkalımı 1 yıldan 5 yıla çıkararak 3,4,5 yıl aralamıştır. Ne yazık ki, imatinib edinilmiş KIT mutasyonları nedeniyle nadiren küratiftir, bu nedenle bu tümör için yeni tedavilere ihtiyaç vardır.
Fare modelleri, kanserde yeni tedavilerin araştırılmasında önemli bir araştırma aracıdır. GİST 6,7’de multipl subkutan ksenogreft ve hasta kaynaklı ksenogreft modelleri geliştirilmiş ve araştırılmıştır. Bununla birlikte, immün yetmezlikli fareler insan GİST’ini tam olarak temsil etmemektedir, çünkü GİST’ler onkojenik mutasyonlarına bağlı olarak farklı bağışıklık profilleri barındırmaktadır ve gastrointestinal tümör mikroçevresinin değiştirilmesi TKİ tedavisinin etkilerini iyileştirmektedir 8,9. KitV558Δ/+ fare, Kit ekzon 11’de, insan GIST10’da en sık mutasyona uğramış bölge olan yan yana membran alanını kodlayan heterozigot bir germline delesyonuna sahiptir. KitV558Δ / + fareleri% 100 penetranslı tek bir çekal GİST geliştirir ve tümörler insan GIST 8,11,12,13 ile benzer histoloji, moleküler sinyalizasyon, immün infiltrasyon ve tedaviye yanıta sahiptir. Burada, GİST’te moleküler ve immünolojik araştırmalarda kullanılmak üzere KitV558Δ/+ farelerde üreme, tedavi ve numune izolasyonu ve işlenmesini açıklıyoruz.
KitV558Δ/+ fare modeli, GİST’in moleküler ve immünolojik analizinde güçlü bir araştırma aracıdır. Üreme stratejisi tek bir haç gerektirse de, tümör yanıtını analiz eden deneylerde KitV558Δ / + fare kohortlarının kullanılması kapsamlı bir üreme gerektirir. Benzer tümör ağırlıklarını sağlamak için fareler yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır ve farelerin% 10’u tümörler kurulduğunda 8 haftalıktan önce ölür. Bireysel farelerde tümör hacmini izl…
The authors have nothing to disclose.
KitV558Δ/+ fareler genetik olarak tasarlanmış ve Dr. Peter Besmer10 tarafından paylaşılmıştır. Bu çalışma NIH hibeleri R01 CA102613 ve T32 CA251063 tarafından desteklenmiştir.
100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
vivaCT 80 platform | Scanco medical |