טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול
Summary
מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר Kit V558Δ/+ ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.
Abstract
גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST) הוא הסרקומה האנושית הנפוצה ביותר והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה אחת בקולטן KIT. על פני סוגי גידולים, פותחו מודלים רבים של עכברים על מנת לחקור את הדור הבא של הטיפולים בסרטן. עם זאת, ב- GIST, רוב מחקרי in vivo משתמשים במודלים של עכברי קסנוגרפט שיש להם מגבלות מובנות. כאן, אנו מתארים מודל עכברי בעל יכולת חיסונית, מהונדס גנטית, של גידול סטרומלי במערכת העיכול עם מוטציה של KitV558Δ/+ . במודל זה, KIT המוטנטי, האונקוגן האחראי על רוב ה-GISTs, מונע על ידי המקדם האנדוגני שלו המוביל ל-GIST המחקה את המראה ההיסטולוגי ואת החדירה החיסונית שנראית ב-GISTs אנושיים. יתר על כן, מודל זה שימש בהצלחה כדי לחקור הן טיפולים מולקולריים ממוקדים והן טיפולים חיסוניים. כאן, אנו מתארים את הרבייה והתחזוקה של מושבת עכברים Kit V558Δ/+ . בנוסף, מאמר זה מפרט את הטיפול והרכש של GIST, ניקוז בלוטות לימפה מזנטרית, וצקום צמוד בעכברי KitV558Δ/+ , כמו גם הכנה לדוגמה לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים.
Introduction
GIST היא הסרקומה הנפוצה ביותר בבני אדם עם שכיחות של כ -6,000 מקרים בארצות הברית של אמריקה1. נראה כי מקורו של GIST בתאי קוצב הלב במערכת העיכול הנקראים תאי הביניים של קאג’אל, והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה בודדת בטירוזין קינאז KIT או PDGFRA2. ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול ב- GIST ויכול להיות מרפא, אך חולים עם מחלה מתקדמת עשויים להיות מטופלים עם מעכב טירוזין קינאז (TKI), imatinib. מאז הצגתו לפני למעלה מ-20 שנה, אימטיניב שינתה את פרדיגמת הטיפול ב-GIST, ושיפרה את ההישרדות במחלות מתקדמות מ-1 ליותר מ-5 שנים 3,4,5. למרבה הצער, imatinib הוא רק לעתים רחוקות מרפא בשל מוטציות KIT נרכש, ולכן יש צורך בטיפולים חדשים עבור גידול זה.
מודלים של עכברים הם כלי מחקרי חשוב בחקר טיפולים חדשניים בסרטן. מספר מודלים תת עוריים של קסנוגרפט וקסנוגרפט שמקורם בחולה פותחו ונחקרו ב-GIST 6,7. עם זאת, עכברים אימונו-יעילים אינם מייצגים באופן מלא את ה-GIST האנושי מכיוון ש-GISTs הם בעלי פרופיל חיסוני דיפרנציאלי בהתאם למוטציה האונקוגנית שלהם, ושינוי המיקרו-סביבה של הגידול במערכת העיכול משפר את ההשפעות של טיפול TKI 8,9. לעכבר KitV558Δ/+ יש מחיקה של חיידק הטרוזיגוטי ב-Kit exon 11, המקודדת את תחום ה-juxtamembrane, האתר בעל המוטציה הנפוצה ביותר ב-GIST10 האנושי. עכברי KitV558Δ/+ מפתחים GIST סקאל יחיד עם 100% חדירה, ולגידולים יש היסטולוגיה דומה, איתות מולקולרי, חדירה חיסונית ותגובה לטיפול כמו GIST 8,11,12,13 אנושי. כאן, אנו מתארים רבייה, טיפול ובידוד ועיבוד דגימות בעכברי KitV558Δ/+ לשימוש במחקר מולקולרי ואימונולוגי ב- GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל העכבר Kit V558Δ/+ הוא כלי מחקר רב עוצמה בניתוח מולקולרי ואימונולוגי של GIST. למרות שאסטרטגיית הרבייה דורשת צלב יחיד, שימוש בקבוצת עכברים Kit V558Δ/+ בניסויים המנתחים את תגובת הגידול דורש רבייה נרחבת. עכברים צריכים להיות מותאמי גיל ומין כדי להבטיח משקל גידול דומה, ו -10% מהעכב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עכברי קיטV558Δ/+ הונדסו גנטית ושותפו על ידי ד”ר פיטר בסמר10. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA102613 ו- T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
