本手稿的目的是描述 试剂盒V558Δ/+小鼠模型以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。
胃肠道间质瘤(GIST)是最常见的人肉瘤,通常由KIT受体中的单个突变驱动。在各种肿瘤类型中,已经开发了许多小鼠模型,以研究下一代癌症疗法。然而,在GIST中,大多数 体内 研究使用具有固有局限性的异种移植小鼠模型。在这里,我们描述了一种免疫功能正常的,基因工程化的胃肠道间质瘤小鼠模型,该模型含有 KitV558Δ / + 突变。在这个模型中,突变的KIT是负责大多数GIST的癌基因,由其内源性启动子驱动,导致GIST模仿人类GIST中的组织学外观和免疫浸润。此外,该模型已成功用于研究靶向分子和免疫疗法。在这里,我们描述了 KitV558Δ/+ 小鼠群落的繁殖和维护。此外,本文详细介绍了 KitV558Δ/+ 小鼠中GIST,引流肠系膜淋巴结和邻近盲肠的治疗和获取,以及用于分子和免疫学分析的样品制备。
GIST是人类最常见的肉瘤,在美国发病率约为6,000例1。GIST似乎起源于称为Cajal间质细胞的胃肠道起搏器细胞,通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA2中的单个突变驱动。手术是 GIST 的主要治疗方法,可以治愈,但晚期疾病患者可以使用酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 伊马替尼进行治疗。自20多年前推出以来,伊马替尼已经改变了GIST的治疗模式,将晚期疾病的生存率从1年提高到5年以上3,4,5。不幸的是,由于获得性KIT突变,伊马替尼很少能治愈,因此需要新的治疗方法来治疗这种肿瘤。
小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。GIST6,7中已经开发并研究了多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型。然而,免疫缺陷小鼠不能完全代表人类GIST,因为GISTs根据其致癌突变具有不同的免疫谱,并且改变胃肠道肿瘤微环境可改善TKI治疗的效果8,9。KitV558Δ/+小鼠在 Kit 外显子 11 中具有杂合子种系缺失,该基因系对并列膜结构域进行编码,这是人类 GIST10 中最常见的突变位点。KitV558Δ/+小鼠发展出具有100%外显率的单个盲肠GIST,并且肿瘤具有与人类GIST8,11,12,13相似的组织学,分子信号传导,免疫浸润和对治疗的反应。在这里,我们描述了KitV558Δ / +小鼠中的育种,处理以及标本分离和处理,用于GIST中的分子和免疫学研究。
试剂盒V558Δ/+小鼠模型是GIST分子和免疫学分析的强大研究工具。虽然育种策略需要单次杂交,但在分析肿瘤反应的实验中使用KitV558Δ/+小鼠队列需要广泛的育种。小鼠的年龄和性别应匹配,以确保相似的肿瘤重量,并且10%的小鼠在肿瘤建立时在8周龄之前死亡。如果使用先进的成像技术(如CT或MRI)来跟踪个体小鼠内的肿瘤体积,则可能采用不太广泛的育种策略。尽管?…
The authors have nothing to disclose.
KitV558Δ/+ 小鼠经过基因工程改造,由彼得·贝斯梅尔博士10共享。这项工作得到了NIH拨款R01 CA102613和T32 CA251063的支持。
100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
vivaCT 80 platform | Scanco medical |