Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.
Las redes de microtúbulos se emplean en las células para realizar una amplia gama de tareas, que van desde actuar como pistas para el transporte de vesículas hasta trabajar como matrices especializadas durante la mitosis para regular la segregación cromosómica. Las proteínas que interactúan con los microtúbulos incluyen motores como las quinesinas y la dineína, que pueden generar fuerzas activas y movimiento direccional, así como proteínas no motoras que entrecruzan filamentos en redes de orden superior o regulan la dinámica del filamento. Hasta la fecha, los estudios biofísicos de las proteínas asociadas a microtúbulos se han centrado abrumadoramente en el papel de las proteínas motoras individuales necesarias para el transporte de vesículas, y se ha logrado un progreso significativo en la elucidación de las propiedades generadoras de fuerza y la regulación mecanoquímica de las quinesinas y las dineínas. Sin embargo, para los procesos en los que los microtúbulos actúan como carga y pista, como durante el deslizamiento del filamento dentro del huso mitótico, se entiende mucho menos sobre la regulación biofísica de los conjuntos de las proteínas de reticulación involucradas. Aquí, detallamos nuestra metodología para sondear directamente la generación de fuerza y la respuesta dentro de redes mínimas de microtúbulos reticulados reconstituidas a partir de microtúbulos purificados y proteínas mitóticas. Los pares de microtúbulos están entrecruzados por proteínas de interés, un microtúbulo se inmoviliza a un cubreobjetos de microscopio y el segundo microtúbulo es manipulado por una trampa óptica. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total simultánea permite la visualización multicanal de todos los componentes de esta red de microtúbulos a medida que los filamentos se separan para generar fuerza. También demostramos cómo estas técnicas se pueden utilizar para sondear las fuerzas de empuje ejercidas por los conjuntos de quinesina-5 y cómo surgen fuerzas de frenado viscosas entre pares de microtúbulos deslizantes reticulados por el MAP mitótico PRC1. Estos ensayos proporcionan información sobre los mecanismos de ensamblaje y función del huso y pueden adaptarse más ampliamente para estudiar la mecánica de la red de microtúbulos densos en diversos contextos, como el axón y las dendritas de las neuronas y las células epiteliales polares.
Las células emplean redes de microtúbulos para realizar una amplia variedad de tareas mecánicas, que van desde el transporte de vesículas 1,2,3 hasta la segregación cromosómica durante la mitosis 4,5,6. Muchas de las proteínas que interactúan con los microtúbulos, como las proteínas motoras moleculares quinesina y dineína, generan fuerzas y están reguladas por cargas mecánicas. Para comprender mejor cómo funcionan estas moléculas críticas, los investigadores han empleado métodos biofísicos de una sola molécula, como la captura óptica y la microscopía TIRF, para monitorear directamente parámetros críticos como las tasas de paso descargadas, la procesividad y las relaciones fuerza-velocidad para proteínas individuales. La geometría experimental más utilizada ha sido unir proteínas motoras directamente a las perlas de captura cuya geometría esférica y tamaño imitan vesículas sometidas a transporte motorizado. Numerosas quinesinas, incluyendo kinesina-1 7,8,9, kinesina-2 10,11,12, kinesina-3 13,14,15,16 kinesina-517,18, kinesina-8 19,20, así como complejos de dineína y dineína21,22, 23,24,25, han sido estudiados con estos métodos.
En muchos procesos celulares, sin embargo, las proteínas motoras y no motoras utilizan microtúbulos como pista y carga26,27. Además, en estos escenarios donde los filamentos de microtúbulos están entrecruzados en haces de orden superior, estas proteínas funcionan como conjuntos en lugar de unidades individuales. Por ejemplo, dentro de las células somáticas en división, las redes de filamentos densos se autoorganizan para construir el aparato del huso mitótico28,29,30. La red de microtúbulos del huso interpolar es altamente dinámica y está dispuesta en gran medida con extremos negativos apuntando hacia los polos del huso y extremos más que se superponen cerca del ecuador del huso. Los filamentos dentro del huso están reticulados por proteínas motoras como kinesina-5 31,32,33, quinesina-12 34,35,36 y kinesina-1437,38,39, o por proteínas no motoras como PRC1 40,41,42,43 o NuMA 44,45, 46. Con frecuencia se mueven o experimentan estrés mecánico durante procesos como el flujo hacia los polos o al coordinar el centrado cromosómico durante la metafase o la segregación cromosómica durante la anafase 47,48,49,50,51,52. La integridad del aparato del huso a escala micrométrica a través de la mitosis, por lo tanto, se basa en un equilibrio cuidadosamente regulado de las fuerzas de empuje y tracción generadas y sostenidas por esta red de filamentos que interactúan. Sin embargo, las herramientas necesarias para investigar esta regulación mecánica y explicar cómo los conjuntos de proteínas funcionan en concierto para coordinar los movimientos de los microtúbulos y producir las fuerzas necesarias para ensamblar adecuadamente el huso se han desarrollado recientemente, y apenas estamos empezando a comprender las reglas biofísicas que definen las redes dinámicas de microtúbulos.
El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos necesarios para reconstituir pares de microtúbulos reticulados in vitro, inmovilizar estos haces en una cámara de microscopía que permita la visualización simultánea de fluorescencia tanto de los microtúbulos como de las proteínas de reticulación y la medición de la fuerza a nanoescala, y procesar estos datos de manera robusta. Detallamos los pasos necesarios para polimerizar de manera estable los microtúbulos marcados con fluorescencia, preparar cubreobjetos de microscopio para su fijación, preparar perlas de poliestireno para experimentos de captura óptica y ensamblar redes de filamentos reticulados que preservan su funcionalidad in vivo al tiempo que permiten la manipulación biofísica directa.
Las redes de microtúbulos son empleadas por innumerables tipos de células para realizar una amplia gama de tareas que son fundamentalmente de naturaleza mecánica. Para describir cómo funcionan las células tanto en estados sanos como en estados de enfermedad, es fundamental comprender cómo estas redes a escala micrométrica están organizadas y reguladas por las proteínas de tamaño nanométrico que las construyen colectivamente. Las herramientas biofísicas, como las pinzas ópticas, son muy adecuadas para sondear…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer el apoyo de R21 AG067436 (a JP y SF), T32 AG057464 (a ET) y Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (a SF).
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915–96 | |
TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |