Здесь мы представляем протокол восстановления пучков микротрубочек in vitro и непосредственной количественной оценки сил, оказываемых внутри них, с помощью одновременного оптического улавливания и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Этот анализ позволяет измерять на наноуровневом уровне силы и смещения, генерируемые белковыми ансамблями в активных сетях микротрубочек.
Сети микротрубочек используются в клетках для выполнения широкого круга задач, начиная от действия в качестве треков для переноса пузырьков до работы в качестве специализированных массивов во время митоза для регулирования сегрегации хромосом. Белки, которые взаимодействуют с микротрубочками, включают такие двигатели, как кинезины и динеин, которые могут генерировать активные силы и направленное движение, а также немоторные белки, которые сшивают нити в сети более высокого порядка или регулируют динамику нитей. На сегодняшний день биофизические исследования белков, связанных с микротрубочками, в подавляющем большинстве случаев сосредоточены на роли одиночных моторных белков, необходимых для переноса пузырьков, и был достигнут значительный прогресс в выяснении силообразующих свойств и механохимической регуляции кинезинов и динеинов. Однако для процессов, в которых микротрубочки действуют как груз, так и как путь, например, во время скольжения нити внутри митотического веретена, гораздо меньше понимается о биофизической регуляции ансамблей вовлеченных сшивающих белков. Здесь мы подробно описываем нашу методологию непосредственного зондирования генерации силы и реакции в сшитых минимальных сетях микротрубочек, восстановленных из очищенных микротрубочек и митотических белков. Пары микротрубочек сшиваются интересующими белками, одна микротрубочка иммобилизуется в крышку микроскопа, а вторая микротрубочка управляется оптической ловушкой. Одновременная флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения позволяет осуществлять многоканальную визуализацию всех компонентов этой сети микротрубочек, поскольку нити раздвигаются для создания силы. Мы также демонстрируем, как эти методы могут быть использованы для зондирования толкающих сил, оказываемых ансамблями кинезин-5, и как вязкие тормозные силы возникают между скользящими парами микротрубочек, сшитыми митотическим MAP PRC1. Эти анализы дают представление о механизмах сборки и функционирования веретена и могут быть более широко адаптированы для изучения плотной сетевой механики микротрубочек в различных контекстах, таких как аксон и дендриты нейронов и полярных эпителиальных клеток.
Клетки используют сети микротрубочек для выполнения широкого спектра механических задач, начиная от переносапузырьков 1,2,3 до сегрегации хромосом во время митоза 4,5,6. Многие из белков, которые взаимодействуют с микротрубочками, такие как молекулярные моторные белки кинезин и динеин, генерируют силы и регулируются механическими нагрузками. Чтобы лучше понять, как функционируют эти критические молекулы, исследователи использовали одномолекулярные биофизические методы, такие как оптическое улавливание и микроскопия TIRF, для непосредственного мониторинга критических параметров, таких как скорость разгруженного шага, качучесть и отношения силы-скорости для отдельных белков. Наиболее часто используемой экспериментальной геометрией было прикрепление моторных белков непосредственно к улавливающим шарикам, сферическая геометрия и размер которых имитируют везикулы, подвергающиеся моторному транспорту. Многочисленные кинезины, в том числе кинезин-1 7,8,9, кинезин-2 10,11,12, кинезин-3 13,14,15,16 кинезин-5 17,18, кинезин-819,20, а также динеиновые и динеиновые комплексы21,22, 23,24,25 были изучены с помощью этих методов.
Однако во многих клеточных процессах моторные и немоторные белки используют микротрубочки как в качестве трека, так и в качестве груза26,27. Более того, в этих сценариях, где нити микротрубочек сшиваются в пучки более высокого порядка, эти белки функционируют как ансамбли, а не отдельные единицы. Например, внутри делящихся соматических клеток плотные нитевидные сети самоорганизуются для построения митотического веретенообразного аппарата 28,29,30. Межполярная сеть микротрубочек шпинделя очень динамична и в значительной степени расположена с минусовыми концами, указывающими на полюса шпинделя, и плюс-концами, перекрывающимися вблизи экватора шпинделя. Нити внутри веретена сшиты моторными белками, такими как кинезин-5 31,32,33, кинезин-12 34,35,36 и кинезин-14 37,38,39, или немоторными белками, такими как PRC1 40,41,42,43 или NuMA 44,45, 46. Они часто перемещаются или испытывают механическое напряжение во время таких процессов, как поток в направлении полюса или при координации центрирования хромосом во время метафазы или сегрегации хромосом во время анафазы 47,48,49,50,51,52. Таким образом, целостность аппарата веретена микронного масштаба посредством митоза зависит от тщательно регулируемого баланса сил толкания и притяжения, создаваемых и поддерживаемых этой сетью взаимодействующих нитей. Тем не менее, инструменты, необходимые для исследования этой механической регуляции и объяснения того, как белковые ансамбли работают согласованно, чтобы координировать движения микротрубочек и производить силы, необходимые для правильной сборки веретена, были разработаны только недавно, и мы только начинаем понимать биофизические правила, которые определяют динамические сети микротрубочек.
Цель этой рукописи состоит в том, чтобы продемонстрировать шаги, необходимые для воссоздания сшитых пар микротрубочек in vitro, иммобилизации этих пучков в камере микроскопии, которая позволяет одновременно флуоресцентную визуализацию как микротрубочек, так и сшивающих белков и наноразмерного измерения силы, и надежно обрабатывать эти данные. Мы подробно описываем шаги, необходимые для стабильной полимеризации флуоресцентных меченых микротрубочек, подготовки крышек микроскопа к прикреплению, подготовки полистирольных шариков для экспериментов по оптическому улавливанию и сборки сшитых нитевидных сетей, которые сохраняют свою функциональность in vivo , позволяя проводить прямые биофизические манипуляции.
Сети микротрубочек используются множеством типов клеток для выполнения широкого круга задач, которые по своей природе являются механическими. Чтобы описать, как клетки функционируют как в здоровом, так и в болезненном состоянии, важно понять, как эти микронные сети организованы и регу…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны R21 AG067436 (JP и SF), T32 AG057464 (et) и Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (sF).
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915–96 | |
TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |