Протокол описывает диагностический метод SARS-CoV-2, который использует автоматизацию с открытым исходным кодом для выполнения молекулярного тестирования образцов слюны RT-qPCR. Этот масштабируемый подход может быть применен к клиническому надзору за общественным здравоохранением, а также для увеличения потенциала небольших университетских лабораторий.
Появление недавнего глобального кризиса в области здравоохранения SARS-CoV-2 создало ключевые проблемы для эпидемиологических исследований и клинических испытаний. Пандемия COVID-19, характеризующаяся высоким уровнем передачи и низкой смертностью, потребовала точного и эффективного диагностического тестирования, особенно в закрытых группах населения, таких как университеты-интернаты. Первоначальная доступность тестирования нуклеиновых кислот, таких как мазки из носоглотки, была ограничена из-за давления в цепочке поставок, которое также задерживало представление результатов испытаний. Тестирование количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR) на основе слюны показало, что оно сопоставимо по чувствительности и специфичности с другими методами тестирования, а сбор слюны менее физически инвазивный для участников. Следовательно, мы разработали мультиплексный диагностический анализ RT-qPCR для наблюдения за населением Университета Клемсона и окружающего сообщества. В анализе использовались роботы с открытым исходным кодом для обработки жидкостей и термоциклеры вместо сложных систем клинической автоматизации для оптимизации рабочего процесса и гибкости системы. Автоматизация RT-qPCR на основе слюны позволяет быстро и точно обнаруживать широкий диапазон концентраций вирусных РНК как для крупномасштабных, так и для небольших испытаний. Средний оборот автоматизированной системы составил < 9 ч для 95% образцов и < 24 ч для 99% образцов. Стоимость одного теста составляла 2,80 доллара, когда все реагенты закупались в больших количествах.
Тяжелый острый респираторный синдром,ассоциированный коронавирус-2 (SARS-CoV-2), новый коронавирус, появился в конце 2019 года и быстро распространился среди населения мира1. Инфекция SARS-CoV-2 вызывает коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), очень заразное заболевание с потенциально тяжелыми респираторными и воспалительными симптомами. Высокая трансмиссивность в сочетании с низкой смертностью указывает на то, что вирус будет быстро распространяться среди населения и потребует расширения диагностического тестирования2,3. Рекомендации общественного здравоохранения поощряли широкомасштабный скрининг населения для выявления случаев заболевания и последующего снижения показателей передачи4,5,6. Кроме того, модели популяционного эпиднадзора показали, что увеличение частоты тестирования и сокращение времени отчетности оказывают большее влияние на снижение передачи, чем повышение чувствительности тестов7. Вероятно, это связано с тем, что инфицированные люди могут быть помещены в карантин раньше, тем самым разрывая цепочки инфекции.
Первоначальным стандартом тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) были мазки из носоглотки (NP), обработанные RT-qPCR8. Однако с этой формой тестирования для очень больших групп населения возникают осложнения, такие как увеличение относительной стоимости и обострение давления в цепочке поставок9,10. Кроме того, как сбор образцов, так и обработка общих методов NAAT (включая тампоны NP, ротоглоточные тампоны, мазки средней раковины и мазки из носа) зависят от специализированного оборудования, реагентов и медицинского персонала9,10.
Адекватной заменой тестированию NP-мазка RT-qPCR является тестирование на основе слюны, которое является точным диагностическим инструментом для обнаружения SARS-CoV-211,12,13,14. Непосредственное выполнение RT-qPCR на образцах слюны дает ту же чувствительность и специфичность, что и NP-мазки15. Одним из основных преимуществ тестирования слюны по сравнению с тестированием мазка NP является то, что оно позволяет самостоятельно собирать образцы16. Это сводит к минимуму потребность в медицинском персонале и максимизирует простоту сбора образцов для пациентов, будучи менее инвазивным, чем мазки NP. Кроме того, поскольку образцы слюны не требуют буферов для извлечения образца из тампона (как в случае образцов NP), тесты на основе слюны могут напрямую использовать экстракцию рибонуклеиновой кислоты (РНК) на тепловой основе, что снижает затраты на тестирование за счет устранения необходимости в дополнительных буферах, транспортных средах и / или реагентах экстракции РНК14,17.
Научно-исследовательская и образовательная лаборатория Университета Клемсона в области диагностики и вмешательства в болезни (REDDI) была создана для удовлетворения потребностей университета в тестировании и эпиднадзоре за COVID-19. В закрытых группах населения, включая университеты, частое тестирование эпиднадзора в сочетании с социальным дистанцированием дало наиболее благоприятные результаты в эпидемиологических моделях распространенности заболевания18. Консолидированные протоколы CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 и SalivaDirect14 были адаптированы, а автоматизация была использована в клиническом рабочем процессе для снижения затрат и сокращения времени выполнения работ. Предыдущие группы использовали роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей для этапов экстракции РНК SARS-CoV-220,21, но мы максимизировали использование роботов для подготовки тестовых пластин и образцов нагрузки22. Здесь мы показываем, что адаптированный протокол и использование систем обработки жидкостей с открытым исходным кодом (рисунок 1) позволяют быстро и точно проводить RT-qPCR на основе слюны и являются эффективной стратегией для крупномасштабного эпиднадзора за общественным здравоохранением.
Анализ, описанный в протоколе, был оценен независимым валидационным исследованием. Было обнаружено, что анализ имел 98,9% специфичности (1,1% ложноположительных) и 90,0% чувствительности (10,0% ложноотрицательных) при оценке по парным мазкам из носоглотки, взятым в то же время (n = 837; 817 отрицательных, 20 положительных). Важно отметить, что три участника, которые дали положительный результат с TigerSaliva и отрицательный с мазком из носоглотки, были повторно протестированы с мазками через 48 часов и вернули положительные результаты, указывающие на то, что TigerSaliva может быть в состоянии обнаружить инфекции SARS-CoV-2 ранее в ходе болезни.
Мы смоделировали положительные образцы слюны путем всплеска невирусной слюны (как термически обработанной, так и нетермически обработанной) с известными концентрациями синтетической РНК SARS-CoV-2 и выполнили 10-кратное разведение для определения предела Ct в слюне. Ген N1 не был обнаружен ниже 10 000 копий генов (приблизительно Ct = 28) в смоделированных положительных образцах. Мы подозреваем, что это связано с деградацией РНКазы или другими мешающими факторами. Однако взаимодействие РНаз слюны с голой синтетической РНК, вероятно, отличается от взаимодействия с вирусными частицами, даже после того, как они были денатурированы теплом. Положительные образцы слюны были идентифицированы с помощью Ct >30, и внешние лаборатории получили данные генетической последовательности SARS-CoV-2 из этих образцов. Мы предполагаем, что вирусные белки обеспечивают защиту от деградации РНК в образцах слюны пациентов.
Наиболее важным этапом в протоколе является внедрение автоматизации подготовки мастер-микса и обработки проб слюны (разделы 4 и 7 соответственно). Это позволяет перекрывать процессы задач, что значительно сокращает время выполнения работ. Другим важным этапом является интерпретация клинических результатов (разделы 11 и 12). Установление промежуточных категорий результатов (повторный запуск и повторный запуск N1) также сводило к минимуму возникновение неубедительных результатов испытаний.
Мы продемонстрировали, что различия между ручными и автоматизированными методами загрузки образцов слюны незначительны (рисунок 5A) и что автоматизация может улучшить воспроизводимость обнаружения SARS-CoV-2 (рисунок 5B). Следует отдавать предпочтение автоматизации для облегчения тестирования при проектировании и расширении клинических лабораторий25. Улучшается лабораторный документооборот с реализацией роботизированных автоматизированных задач26. Возможности роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей позволяют реализовать пользовательские сценарии для разработки протоколов. Это делает роботов для обработки жидкостей недорогой и легко модифицируемой системой по сравнению с традиционными методами клинической автоматизации. Это также идеальная стратегия для выполнения повторяющихся лабораторных задач. Высокий уровень настраиваемости системы приводит к свободе изменять лабораторную посуду (например, коллекторные трубки, наконечники пипеток или пластины на 384 скважины) в случае нехватки. Таким образом, автоматизация с использованием роботов для обработки жидкостей жизнеспособна как для крупномасштабного, так и для мелкомасштабного наблюдения и исследований.
Основным преимуществом этой стратегии тестирования является гораздо более короткое время обработки по сравнению с другими клиническими лабораториями. Использование автоматизированных роботов для обработки жидкостей играет ключевую роль в сокращении времени обработки, но одновременное использование роботов и термоциклеров также играет важную роль в максимизации эффективности тестирования. Один робот и термоциклер должны работать как пара, где обе машины используются в тандеме для непрерывной загрузки образцов и анализа результатов проб. Как только постоянный поток назначенных образцов установлен, все пары машин могут работать одновременно. Постоянное одновременное использование роботов и термоциклеров резко увеличивает производительность и эффективность тестирования, что имеет решающее значение для размещения большого объема испытаний.
В отличие от других установленных протоколов SARS-CoV-2 RT-qPCR, мы включили шаг приземления в протокол термоциклера для улучшения отжига набора зонда и праймера к генам-мишеням27, снижая риск неудачной амплификации. Результаты показали, что приземление улучшило обнаружение положительных образцов без риска потери специфического связывания грунтовки (таблица 4). Мы определили, что широкий спектр как копий РНК SARS-CoV-2 (рисунок 4A), так и Hs_RPP30 копий ДНК (рисунок 4B) может быть одновременно обнаружен с помощью анализа RT-qPCR.
Одним из ограничений роботов для обработки жидкостей является возможность перекрестного загрязнения от положительных образцов во время переноса слюны. Слюна представляет собой вязкоупругую жидкость28 и может нанизываться на соседние колодцы после дозирования из кончика пипетки. Кроме того, неоднородность слюны29 может привести к неравномерному распределению вирусных частиц по всему образцу. Это увеличивает вероятность как ложноположительных, так и отрицательных результатов, что требует обозначения образцов N1 Rerun и Rerun. Тем не менее, 14,1% образцов, первоначально обозначенных как N1 Rerun, разрешились как положительные для SARS-CoV-2 и более чем в 30 раз чаще, чем повторные образцы, разрешались как положительные после повторного тестирования. Следовательно, дифференциация Rerun от N1 Rerun (рисунок 3) позволила более точно разделить потенциально положительные образцы, повысив чувствительность и специфичность нашего диагностического анализа. Другие результирующие параметры для диагностического тестирования слюны не сделали этого различия12,14,24,30,31.
Образцы слюны может быть трудно пипеткой из-за неоднородности и вязкости32. Термическая обработка адекватно денатурирует белки в биоматрице слюны, снижая вязкость и устраняя необходимость в реагентах для экстракции РНК9, которых не хватало на ранних стадиях пандемии10. Расширенная термическая обработка также инактивирует присутствующие вирусы33, что позволяет проводить лабораторную обработку при более низких уровнях биобезопасности. Следовательно, экстракция РНК на тепловой основе (описанная в разделе 5.4) была реализована для снижения вязкости за счет денатурации белка (рисунок 6). Основываясь на результатах, мы постулируем, что термическая обработка может также гомогенизировать образцы слюны в дополнение к денатурации белковой биоматрицы. Другие группы комбинировали термическую обработку и обработку протеиназой К для повышения однородности9,14,34. Мы решили не реализовывать этот шаг, поскольку он может денатурировать белки вириона со скоростью, которая оставляет вирусную РНК подверженной тепловой деградации35. Кроме того, разбавление проб протеиназой К может маскировать положительные образцы, содержащие меньше вирусных частиц, тем самым снижая чувствительность. Кроме того, результаты анализа сравнивались с коммерчески доступным анализом SARS-CoV-2 на основе слюны (Logix Smart COVID-19), в котором используется магнитная экстракция РНК (таблица 5). Было обнаружено, что текущий анализ лучше подходит для обнаружения слабых положительных образцов по сравнению с коммерчески доступным анализом.
Трудно количественно оценить количество копий вируса в слюне, используя только RT-qPCR, потому что qPCR является полуколичественным. Существуют внутренние различия между значениями Ct, которые проистекают из технических ограничений. Номер копии гена может быть определен по значениям Ct (рисунок 4) и примерно эквивалентен номеру вирусной копии. Одним из возможных решений для определения числа вирусных копий в образцах слюны является ddPCR, который обеспечивает жесткую количественную оценку копий генов в реакции. Тем не менее, мы считаем, что достаточно предоставить качественные результаты клиницистам, и относительное содержание вируса может быть сравнено с образцами, обработанными нашими методами.
Несмотря на некоторые ограничения, возникающие при использовании слюны, анализ SARS-CoV-2 методом RT-qPCR на основе слюны оказывается эффективным методом быстрого и надежного обнаружения вирусной РНК в любом масштабе тестирования. Это особенно верно в сочетании с использованием систем обработки жидкостей с открытым исходным кодом. Этот подход к тестированию может быть модифицирован для обнаружения других последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих отношение к диагностике, таких как агенты инфекционных заболеваний, маркеры заболеваний или другие вирусы. Это делает анализ применимым как для клинических, так и для исследовательских диагностических усилий.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят администрацию Клемсона, медицинский персонал и сотрудников клинической лаборатории в лаборатории REDDI, которые помогли внедрить и управлять тестированием SARS-CoV-2. Мы благодарим д-ра Филиппа Бакхолтса и д-ра Кэролин Баннистер из Университета Южной Каролины за первоначальный консалтинг по проектам и отраслевые контакты по закупкам оборудования. Мы благодарим многих студентов, преподавателей и сотрудников за помощь в сборе образцов. Спасибо студентам Creative Inquiry за стандартный сбор данных кривых. Финансирование этого исследования было получено от гранта Национального института здравоохранения P20GM121342 (присуждается DD и LGP), Спортивного департамента Клемсона, вице-президента по исследованиям Университета Клемсона и Комитета губернатора Южной Каролины и Объединенного комитета по рассмотрению облигаций.
100% EtOH | Fisher scientific | 22-032-601 | |
20 uL Filtered Pipette Tips | Opentrons | 20uL tips | |
2mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-313 | Alternate product may be used |
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells | Thermo Scientific | AB3384 | Alternate product may be used |
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates | Fisher Scientific | 50-828-743 | For mastermix preparation |
Clear PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0558 | Alternate product may be used |
DPEC Treated Water | Ambion (Thermo Scientific) | AM9916 | |
Flip Cap 50 mL Conical Tubes | VWR | 75845-210 | For sample collection |
Foil PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0626 | For storage of mastermix plates, Alternate product may be used |
HS_RPP30 Synthetic DNA | Integrated DNA Technologies | 299788131 | P1 positive control |
Luna Buffer Probe One-Step Reaction | New England Biolabs | M3006B | |
Luna WarmStart RT Enzyme Mix | New England Biolabs | M3002B | |
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006830 | |
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006832 | Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores |
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006831 | |
Opentron HEPA Filter Module | Opentrons | N/A | Not required, but useful to reduce contamination |
Opentron Multichannel Attachment, P20 | Opentrons | 999-00005 | For mastermix preparation |
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot | Opentrons | OT-2 | |
Opentron Pipette Attachment, P20 | Opentrons | 999-0000215 | For sample loading |
Oven | Memmert | UF450 PLUS 208V-3PH | |
PCR Tubes (rnase, dnase free) | Fisher Scientific | 14-230-225 | For aliquots of positive and neg controls |
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) | VWR | 10808-952 | |
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) | VWR | 10808-956 | |
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10007062 | Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore |
RNAse P Forward Primer, 100nmol | Integrated DNA Technologies | 10006836 | |
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006837 | |
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 | Twist Biosciences | 102024 / 103907 / 103909 | N1 Positive Control |
Scanners | Code | CR1500 | Only required when scaling up |
Small HEPA Filtered Hood | Erlab | Captair Bio 321 | For mastermix preparation |
Thermocycler CFX384 Touch | Biorad | CFX384 Touch | Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus |
X-acto Knife Set | Staples | N/A | To cut foil for keeping control wells covered |