该协议描述了一种SARS-CoV-2诊断方法,该方法利用开源自动化对唾液样本进行RT-qPCR分子检测。这种可扩展的方法可以应用于临床公共卫生监测,也可以用于提高小型大学实验室的能力。
最近SARS-CoV-2全球健康危机的出现给流行病学研究和临床试验带来了重大挑战。COVID-19大流行的特点是传播率高,死亡率低,需要准确有效的诊断检测,特别是在寄宿大学等封闭人群中。核酸检测(如鼻咽拭子)的初始可用性受到限制,因为供应链压力也延迟了检测结果的报告。基于唾液的逆转录酶定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 检测已被证明在敏感性和特异性上与其他检测方法相当,并且唾液收集对参与者的物理侵入性较小。因此,我们开发了一种多重RT-qPCR诊断检测方法,用于克莱姆森大学和周围社区的人口监测。该测定利用开源液体处理机器人和热循环仪代替复杂的临床自动化系统来优化工作流程和系统灵活性。基于唾液的 RT-qPCR 的自动化能够快速准确地检测各种病毒 RNA 浓度,满足大规模和小规模的检测需求。对于95%的样品,自动化系统的平均周转时间为9小时<,对于99%的样品,<24小时。当所有试剂都是批量购买时,单次测试的成本为2.80美元。
严重急性呼吸系统综合征相关冠状病毒-2(SARS-CoV-2)是一种新型冠状病毒,于2019年底出现,并迅速在全球人群中传播1。SARS-CoV-2感染导致2019年冠状病毒病(COVID-19),这是一种高度传染性疾病,可能伴有严重的呼吸道和炎症症状。高传播性加上低死亡率表明,该病毒将在人群中迅速传播,需要增加诊断检测2,3。公共卫生建议鼓励进行大规模人群筛查,以隔离病例并随后降低传播率4,5,6。此外,人群监测模型显示,增加检测频率和缩短报告时间对减少传播的影响大于提高检测灵敏度7。这可能是因为受感染的个体可以更早地被隔离,从而打破感染链。
最初的核酸扩增试验(NAAT)标准品是通过RT-qPCR8处理的鼻咽(NP)拭子。然而,这种针对大量人群的测试形式会产生并发症,例如相对成本增加和供应链压力加剧9,10。此外,常见NAAT方法(包括NP拭子,口咽拭子,鼻中拭子和鼻拭子)的标本采集和处理都依赖于专业设备,试剂和医务人员9,10。
基于唾液的检测是NP拭子RT-qPCR检测的充分替代品,这是SARS-CoV-2检测的准确诊断工具11,12,13,14。直接对唾液样品进行RT-qPCR可产生与NP拭子相似的敏感性和特异性15。与NP拭子测试相比,唾液检测的一个主要优点是它允许自我收集标本16。这最大限度地减少了对医务人员的需求,并通过比NP拭子的侵入性更小,最大限度地提高了患者样本收集的便利性。此外,由于唾液样品不需要缓冲液即可从拭子中取出样品(如NP样品),因此基于唾液的测试可以直接利用热基核糖核酸(RNA)提取,从而通过消除对额外缓冲液,转运介质和/或RNA提取试剂的需求来降低测试成本14,17。
克莱姆森大学疾病诊断与干预研究与教育(REDDI)实验室的成立是为了满足该大学对COVID-19检测和监测的需求。在包括大学在内的封闭人群中,频繁的监测检测加上保持社交距离,在疾病流行率流行病学模型中产生了最有利的结果18。调整了合并后的CDC 2019-nCOV RT-qPCR19和SalivaDirect14方案,并在临床工作流程中利用自动化来降低成本并缩短周转时间。之前的小组曾使用开源液体处理机器人进行SARS-CoV-2 RNA提取步骤20,21,但我们最大限度地利用机器人来准备测试板和加载标本22。在这里,我们表明,适应的方案和开源液体处理系统的利用(图1)允许快速准确地基于唾液的RT-qPCR,并且是大规模公共卫生监测的有效策略。
通过独立的验证研究评估方案中描述的测定。发现,当对同时采集的配对鼻咽拭子进行评估时,该测定具有98.9%的特异性(1.1%假阳性)和90.0%的敏感性(10.0%假阴性)(n = 837;817阴性,20阳性)。重要的是,三名TigerSaliva检测呈阳性,鼻咽拭子检测呈阴性的参与者在48小时后用拭子重新检测并返回阳性结果,表明TigerSaliva可能能够在病程的早期检测到SARS-CoV-2感染。
我们通过用已知浓度的SARS-CoV-2合成RNA对无病毒唾液(热处理和非热处理)进行峰值来模拟阳性唾液样本,并进行10倍稀释以确定唾液中的Ct限值。在模拟阳性样本中,N1基因在10,000个基因拷贝(约Ct = 28)以下无法检测到。我们怀疑这是由于RNase降解或其他混杂因素。然而,唾液RNases与裸合成RNA的相互作用可能与与病毒颗粒的相互作用不同,即使它们已被热变性。Ct >30 鉴定出阳性唾液样本,外部实验室从这些样本中获得了 SARS-CoV-2 基因序列数据。我们推测,病毒蛋白可以防止患者唾液样本中的RNA降解。
该协议中最关键的步骤是实施预混液制备和唾液样品处理的自动化(分别为第4节和第7节)。这允许重叠的任务流程,从而大大减少了周转时间。另一个关键步骤是临床结果解释(第11节和第12节)。建立中间结果类别(重新运行和 N1 重新运行)也最大限度地减少了不确定测试结果的发生。
我们证明了手动和自动唾液样品上样方法之间的差异可以忽略不计(图5A),并且自动化可以提高SARS-CoV-2检测的可重复性(图5B)。在设计和扩展临床实验室时,应优先采用自动化,以方便测试25。通过实施机器人自动化任务,实验室工作流程得到改进26。液体处理机器人的开源功能允许实现协议设计的自定义脚本。与传统的临床自动化方法相比,这使得液体处理机器人成为一种廉价且高度可修改的系统。它也是执行高度重复性实验室任务的理想策略。该系统的高度可定制性转化为在短缺的情况下自由更换实验室器具(例如,收集管,移液器吸头或384孔板)。因此,使用液体处理机器人的自动化对于大规模和小规模的监测和研究都是可行的。
这种测试策略的一个主要优点是相对于其他临床实验室的周转时间要短得多。自动液体处理机器人的利用在缩短周转时间方面起着关键作用,但同时使用机器人和热循环器也有助于最大限度地提高测试效率。一个机器人和热循环器应成对操作,其中两台机器串联使用,以实现不间断的样品上样和样品结果分析。一旦建立了稳定的指定样品流,所有机器对就可以同时操作。机器人和热力循环仪的持续同时使用大大提高了测试能力和效率,这对于适应高测试量至关重要。
与其他已建立的SARS-CoV-2 RT-qPCR方案相比,我们在热循环器方案中加入了一个触地步骤,以改善探针和引物组对靶基因的退火27,从而降低扩增失败的风险。结果表明,着陆改善了阳性样品的检测,而不会有失去特异性引物结合的风险(表 4)。我们确定,RT-qPCR测定可以同时检测广泛的SARS-CoV-2 RNA拷贝(图4A)和Hs_RPP30 DNA拷贝(图4B)。
液体处理机器人的一个局限性是在唾液转移过程中可能从阳性样品中交叉污染。唾液是一种粘弹性液体28,从移液器吸头分配后,可能会穿过相邻的孔。此外,唾液29的异质性可能导致病毒颗粒在整个样品中的分布不均匀。这增加了假阳性和假阴性的可能性,需要指定 N1 重新运行和重新运行样本。然而,最初被指定为N1 Rerun的样本中有14.1%被解析为SARS-CoV-2阳性,并且在重新检测后比重新运行样本解析为阳性的可能性高出30倍以上。因此,将Rerun与N1 Rerun(图3)区分开来可以更准确地分离潜在的阳性样品,从而提高诊断测定的灵敏度和特异性。用于诊断性唾液检测的其他结果参数没有做出这种区分12,14,24,30,31。
由于异质性和粘度,唾液样本可能难以移液32。热处理可充分使唾液生物母细胞中的蛋白质变性,降低粘度并消除对RNA提取试剂的需求9,而RNA提取试剂在大流行的早期阶段是稀缺的10。扩展的热处理还可以灭活现有的病毒33,从而允许在较低的生物安全水平上进行实验室处理。因此,实施了基于热的RNA提取(如第5.4节所述)以通过蛋白质变性降低粘度(图6)。根据结果,我们假设热处理除了使蛋白质生物矩阵变性外,还可以使唾液样品变质。其他组将热处理和蛋白酶K处理相结合,以增加均质性9,14,34。我们选择不实施这一步骤,因为它可能会使病毒粒子蛋白变性,其速度会使病毒RNA暴露于热降解35。此外,用蛋白酶K稀释样品可以掩盖含有较少病毒颗粒的阳性样品,从而降低灵敏度。此外,将测定结果与使用磁珠RNA提取的市售唾液基SARS-CoV-2测定(Logix Smart COVID-19)进行了比较(表 5)。研究发现,与市售检测方法相比,目前的检测方法更适合检测弱阳性样品。
仅使用RT-qPCR很难量化唾液中的病毒拷贝数,因为qPCR是半定量的。由于技术限制,Ct 值之间存在固有的差异。基因拷贝数可以从Ct值确定(图4),大致相当于病毒拷贝数。确定唾液样品中病毒拷贝数的一种可能的解决方案是ddPCR,它可以对反应中的基因拷贝进行硬定量。但是,我们认为,向临床医生提供定性结果是足够的,并且可以在使用我们的方法处理的样本中比较相对病毒含量。
尽管在使用唾液时会出现一些限制,但通过基于唾液的RT-qPCR进行的SARS-CoV-2测定被证明是在任何测试规模下快速可靠地检测病毒RNA的有效方法。当结合使用开源液体处理系统时,尤其如此。可以修改此检测方法以检测与诊断相关的其他核酸序列,例如传染病病原体,疾病标志物或其他病毒。这使得该测定适用于临床和研究诊断工作。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢克莱姆森的行政部门,医务人员和REDDI实验室的临床实验室员工,他们帮助实施和管理SARS-CoV-2检测。我们感谢南卡罗来纳大学的Phillip Buckhaults博士和Carolyn Bannister博士为设备采购提供初步项目咨询和行业联系。我们感谢许多学生,教授和工作人员在样本收集方面的帮助。感谢创意探究学生的标准曲线数据收集。这项研究的资金来自美国国立卫生研究院拨款P20GM121342(授予DD和LGP),克莱姆森体育系,克莱姆森大学研究副总裁以及南卡罗来纳州州长和联合债券审查委员会。
100% EtOH | Fisher scientific | 22-032-601 | |
20 uL Filtered Pipette Tips | Opentrons | 20uL tips | |
2mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-313 | Alternate product may be used |
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells | Thermo Scientific | AB3384 | Alternate product may be used |
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates | Fisher Scientific | 50-828-743 | For mastermix preparation |
Clear PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0558 | Alternate product may be used |
DPEC Treated Water | Ambion (Thermo Scientific) | AM9916 | |
Flip Cap 50 mL Conical Tubes | VWR | 75845-210 | For sample collection |
Foil PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0626 | For storage of mastermix plates, Alternate product may be used |
HS_RPP30 Synthetic DNA | Integrated DNA Technologies | 299788131 | P1 positive control |
Luna Buffer Probe One-Step Reaction | New England Biolabs | M3006B | |
Luna WarmStart RT Enzyme Mix | New England Biolabs | M3002B | |
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006830 | |
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006832 | Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores |
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006831 | |
Opentron HEPA Filter Module | Opentrons | N/A | Not required, but useful to reduce contamination |
Opentron Multichannel Attachment, P20 | Opentrons | 999-00005 | For mastermix preparation |
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot | Opentrons | OT-2 | |
Opentron Pipette Attachment, P20 | Opentrons | 999-0000215 | For sample loading |
Oven | Memmert | UF450 PLUS 208V-3PH | |
PCR Tubes (rnase, dnase free) | Fisher Scientific | 14-230-225 | For aliquots of positive and neg controls |
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) | VWR | 10808-952 | |
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) | VWR | 10808-956 | |
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10007062 | Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore |
RNAse P Forward Primer, 100nmol | Integrated DNA Technologies | 10006836 | |
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006837 | |
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 | Twist Biosciences | 102024 / 103907 / 103909 | N1 Positive Control |
Scanners | Code | CR1500 | Only required when scaling up |
Small HEPA Filtered Hood | Erlab | Captair Bio 321 | For mastermix preparation |
Thermocycler CFX384 Touch | Biorad | CFX384 Touch | Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus |
X-acto Knife Set | Staples | N/A | To cut foil for keeping control wells covered |