הפרוטוקול מתאר שיטת אבחון SARS-CoV-2 המשתמשת באוטומציה בקוד פתוח כדי לבצע בדיקות מולקולריות RT-qPCR של דגימות רוק. גישה מדרגית זו יכולה להיות מיושמת מעקב קליני בריאות הציבור, כמו גם כדי להגדיל את הקיבולת של מעבדות אוניברסיטאיות קטנות יותר.
הופעתו של משבר הבריאות העולמי SARS-CoV-2 לאחרונה הציבה אתגרים מרכזיים למחקר אפידמיולוגי ובדיקות קליניות. מגפת COVID-19, המאופיינת בשיעור הדבקה גבוה ובתמותה נמוכה, דרשה בדיקות אבחון מדויקות ויעילות, במיוחד באוכלוסיות סגורות כגון אוניברסיטאות מגורים. הזמינות הראשונית של בדיקות חומצת גרעין, כמו דגימות האף, הוגבלה עקב לחץ שרשרת האספקה שגם עיכב את הדיווח על תוצאות הבדיקה. בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) המבוססת על רוק, הוכיחה כי היא דומה ברגישות ובספציפיות לשיטות בדיקה אחרות, ואיסוף הרוק פחות פולשני פיזית למשתתפים. כתוצאה מכך, פיתחנו בדיקת אבחון מולטיפלקס RT-qPCR למעקב אוכלוסין של אוניברסיטת קלמסון והקהילה שמסביב. הבדיקה השתמשה ברובוטים ובתרמוציקלים לטיפול בנוזל בקוד פתוח במקום במערכות אוטומציה קלינית מורכבות כדי לייעל את זרימת העבודה ואת גמישות המערכת. אוטומציה של RT-qPCR מבוסס רוק מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של מגוון רחב של ריכוזי RNA נגיפיים הן עבור דרישות בדיקה בקנה מידה גדול והן עבור דרישות בדיקה בקנה מידה קטן. התפנית הממוצעת עבור המערכת האוטומטית הייתה < 9 שעות עבור 95% מהדגימות < 24 שעות עבור 99% מהדגימות. העלות עבור בדיקה אחת הייתה $2.80 כאשר כל הריאגנטים נרכשו בכמויות גדולות.
נגיף נשימה חריף חמור הקשור לקורונה-2 (SARS-CoV-2), נגיף קורונה חדש, הופיע בסוף 2019 והתפשט במהירות באוכלוסיות העולם1. זיהום SARS-CoV-2 גורם למחלת קורונה 2019 (COVID-19), מחלה מדבקת מאוד עם תסמינים נשימתיים ודלקתיים חמורים. יכולת קבילות גבוהה בשילוב עם תמותה נמוכה הצביעו על כך שהנגיף יתפשט במהירות דרך אוכלוסיות וידרוש בדיקות אבחון מוגברות 2,3. המלצות בריאות הציבור עודדו סינון רחב היקף של אוכלוסיות כדי לבודד מקרים ולאחר מכן להפחית את שיעורי ההדבקה4,5,6. יתר על כן, מודלים של מעקב אוכלוסין גילו כי הגדלת תדירות הבדיקות והפחתת זמן הדיווח השפיעו יותר על הפחתת השידור מאשר הגברת הרגישות לבדיקה7. הסיבה לכך היא ככל הנראה כי אנשים נגועים יכולים להיות בהסגר מוקדם יותר, ובכך לשבור את שרשראות ההדבקה.
תקן ההגברה המקורי של חומצת הגרעין (NAAT) היה מטליות האף (NP) שעובדו על ידי RT-qPCR8. עם זאת, סיבוכים מתעוררים עם צורה זו של בדיקות עבור אוכלוסיות גדולות מאוד, כגון עלות יחסית מוגברת ולחץ שרשרת אספקה מוגברת9,10. יתר על כן, הן איסוף ועיבוד דגימות של שיטות NAAT נפוצות (כולל מטליות NP, דגימות oropharyngeal, מטליות טורבינות באמצע, ודגימות האף) מסתמכים על ציוד מיוחד, ריאגנטים, ואנשי צוות רפואי9,10.
תחליף הולם לבדיקות NP RT-qPCR ספוגיות הוא בדיקות מבוססות רוק, המהווה כלי אבחון מדויק לזיהוי SARS-CoV-211,12,13,14. ביצוע ישיר של RT-qPCR על דגימות רוק מניב רגישות וספציפיות דומות כמו מטליות NP15. אחד היתרונות העיקריים של בדיקות רוק יש על בדיקות ספוגית NP הוא שזה מאפשר איסוף עצמי של דגימות16. זה מצמצם את הצורך בצוותים רפואיים וממקסם את הקלות של איסוף מדגם עבור חולים על ידי היותו פחות פולשני מאשר דגימות NP. בנוסף, מאז דגימות רוק אינם דורשים חוצצים כדי להסיר את המדגם מספוגית (כמו במקרה של דגימות NP), בדיקות מבוססות רוק יכול לנצל חומצה ריבונוקלאית מבוססת חום (RNA) מיצוי ישירות, אשר מקטין את עלויות הבדיקה על ידי הסרת הצורך במאגרים נוספים, מדיה הובלה, ו / או ריאגנטים חילוץ RNA14,17.
המעבדה למחקר וחינוך באוניברסיטת קלמסון לאבחון מחלות והתערבות (REDDI) הוקמה כדי לענות על צרכי האוניברסיטה לבדיקות ומעקב של COVID-19. באוכלוסיות סגורות, כולל אוניברסיטאות, בדיקות מעקב תכופות בשילוב עם ריחוק חברתי הניבו את התוצאות החיוביות ביותר במודלים האפידמיולוגיים של שכיחות המחלה18. הפרוטוקולים המאוחדים של CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 ו- RockivaDirect14 הותאמו, ואוטומציה נוצלה בזרימת העבודה הקלינית כדי להפחית את העלות ולשפר את זמן התפנית. קבוצות קודמות השתמשו ברובוטים לטיפול בנוזל בקוד פתוח עבור שלבי חילוץ SARS-CoV-2 RNA20,21, אך הגדלנו את השימוש ברובוטים להכנת לוחות בדיקה ודגימות עומס22. כאן אנו מראים כי הפרוטוקול המותאם והשימוש במערכות טיפול בנוזל בקוד פתוח (איור 1) מאפשרים RT-qPCR מהיר ומדויק המבוסס על רוק ומהווה אסטרטגיה יעילה למעקב נרחב אחר בריאות הציבור.
הבדיקה המתוארת בפרוטוקול הוערכה על ידי מחקר אימות עצמאי. נמצא כי הבדיקה הייתה 98.9% ספציפיות (1.1% חיובי כוזב) ו 90.0% רגישות (10.0% שלילי כוזב) כאשר מוערך נגד דגימות nasopharyngeal מזווג נלקח באותו זמן (n = 837; 817 שלילי, 20 חיובי). חשוב לציין, שלושה משתתפים שנבדקו חיוביים עם TigerSaliva ושלילי עם ספוגית האף נבדקו מחדש עם מטליות 48 שעות מאוחר יותר והחזירו תוצאות חיוביות, מה שמצביע על כך ש- TigerSaliva עשוי להיות מסוגל לזהות זיהומי SARS-CoV-2 מוקדם יותר במהלך המחלה.
דימינו דגימות רוק חיוביות על ידי ספייק רוק ללא וירוסים (הן מטופלים בחום והן לא מטופלים בחום) עם ריכוזים ידועים של SARS-CoV-2 RNA סינתטי וביצע דילול של פי 10 כדי לקבוע את מגבלת ה- Ct ברוק. הגן N1 לא היה ניתן לזיהוי מתחת 10,000 עותקים גנטיים (כ Ct = 28) בדגימות חיוביות מדומות. אנו חושדים שזה בגלל השפלת RNase או גורמים מבלבלים אחרים. עם זאת, האינטראקציה של RNases רוק עם RNA סינתטי עירום הוא כנראה שונה מן האינטראקציה עם חלקיקים ויראליים, גם לאחר שהם כבר denatured על ידי חום. דגימות רוק חיוביות זוהו עם Ct >30 ומעבדות חיצוניות השיגו נתוני רצף גנטי SARS-CoV-2 מדגימות אלה. אנו משערים כי החלבונים הנגיפיים מספקים הגנה מפני השפלת RNA בדגימות רוק החולה.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא יישום אוטומציה להכנת תערובת ראשית ועיבוד מדגם רוק (סעיפים 4 ו -7 בהתאמה). הדבר מאפשר תהליכי משימה חופפים, מה שמקצר באופן דרסטי את זמן התפנית. צעד קריטי נוסף הוא פרשנות תוצאות קליניות (סעיפים 11 ו-12). יצירת קטגוריות תוצאות ביניים (שידור חוזר והפעלה חוזרת של N1) מזערה גם את התרחשותן של תוצאות בדיקה לא חד משמעיות.
הדגמנו שהשונות בין שיטות טעינה ידניות ואוטומטיות של דגימת רוק היא זניחה (איור 5A) ושאוטומציה עשויה לשפר את יכולת השכפול של זיהוי SARS-CoV-2 (איור 5B). אוטומציה צריכה להיות מועדפת כדי להקל על הבדיקות בעת תכנון והרחבה של מעבדות קליניות25. זרימת העבודה במעבדה משופרת עם יישום משימות אוטומטיות רובוט26. יכולות הקוד הפתוח של הרובוטים המטפלים בנוזל מאפשרות יישום של סקריפטים מותאמים אישית לעיצוב פרוטוקול. זה הופך רובוטים לטיפול בנוזלים למערכת זולה וניתנת לשינוי בהשוואה לשיטות אוטומציה קלינית מסורתיות. זוהי גם אסטרטגיה אידיאלית לביצוע משימות מעבדה שחוזרות על עצמן. הרמה הגבוהה של יכולת התאמה אישית של המערכת מתורגמת לחופש לשנות תוכנות מעבדה (למשל, צינורות איסוף, טיפים פיפטה, או לוחות 384-well) במקרה של מחסור. לכן, אוטומציה באמצעות רובוטים לטיפול בנוזלים היא בת קיימא הן עבור מעקב בקנה מידה גדול בקנה מידה קטן ומחקר.
היתרון העיקרי של אסטרטגיית בדיקה זו הוא זמן תפנית קצר בהרבה ביחס למעבדות קליניות אחרות. השימוש ברובוטים אוטומטיים לטיפול בנוזלים ממלא תפקיד מרכזי בהפחתת זמן התפנית, אך שימוש בו-זמני ברובוטים ותרמוציקלים הוא גם אינסטרומנטלי למקסם את יעילות הבדיקה. רובוט אחד ותרמוסיקר צריך להיות מופעל כזוג, שבו שתי המכונות משמשות יחד לטעינת מדגם ללא הפרעה וניתוח תוצאות מדגם. לאחר שנוצרת זרימה קבועה של דגימות שהוקצו, ניתן להפעיל את כל זוגות המכונות בו-זמנית. שימוש מתמיד בו-זמני ברובוטים ובתרמו-מחזורים מגדיל באופן דרסטי את יכולת הבדיקה ואת היעילות, וזה חיוני כדי להתאים לנפח הבדיקות הגבוה.
בניגוד לפרוטוקולים מבוססים אחרים של SARS-CoV-2 RT-qPCR, כללנו שלב טאצ’דאון בפרוטוקול התרמוציקלר כדי לשפר את חישול הגשושית וערכות הפריימר לגנים היעד27, ובכך להפחית את הסיכון להגברה כושלת. התוצאות הראו כי הטאצ’דאון שיפר את הזיהוי של דגימות חיוביות מבלי להסתכן באובדן של איגוד פריימר ספציפי (טבלה 4). קבענו שניתן לזהות בו-זמנית מגוון רחב של עותקי RNA של SARS-CoV-2 (איור 4A) ועותקי דנ”א Hs_RPP30 (איור 4B) על-ידי בדיקת RT-qPCR.
מגבלה אחת של רובוטים לטיפול בנוזלים היא האפשרות של זיהום צולב מדגימות חיוביות במהלך העברת רוק. רוק הוא נוזל ויסקולסטי28 ועשוי להיגרר על פני בארות סמוכות לאחר שהופץ מקצה הפיפטה. יתר על כן, ההטרוגניות של הרוק29 עלולה לגרום להפצה לא אחידה של חלקיקים ויראליים בכל המדגם. זה מגדיל את האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות ושליליות, המחייבות את ייעודן של דגימות N1 Rerun ו- Rerun. עם זאת, 14.1% מהדגימות שהוגדרו בתחילה כ- N1 Rerun נפתרו כחיוביות עבור SARS-CoV-2 והיו בסיכון גבוה פי 30 מאשר דגימות שידור חוזר כדי לפתור כחיוביות לאחר בדיקה חוזרת. כתוצאה מכך, הבחנה בין שידור חוזר ל-N1 Rerun (איור 3) אפשרה הפרדה מדויקת יותר של דגימות שעשויות להיות חיוביות, והגבירה את הרגישות והספציפיות של בדיקת האבחון שלנו. פרמטרים אחרים שהתקבלו לבדיקות רוק אבחנתיות לא עשו הבחנה זו12,14,24,30,31.
דגימות רוק יכול להיות קשה פיפטה בשל הטרוגניות וצמיגות32. טיפול בחום מפחית כראוי חלבונים בביומטריקס הרוק, מפחית את הצמיגות ומבטל את הצורך בריאגנטים להפקת RNA9, שהיו נדירים בשלבים המוקדמים של המגפה10. טיפול בחום ממושך גם מנטרל וירוסים קיימים33 המאפשר עיבוד מעבדה ברמות בטיחות ביולוגית נמוכות יותר. כתוצאה מכך, מיצוי RNA מבוסס חום (המתואר בסעיף 5.4) יושם כדי להפחית את הצמיגות באמצעות denaturation חלבון (איור 6). בהתבסס על התוצאות, אנו מניחים כי טיפול בחום עשוי גם הומוגניזציה דגימות רוק בנוסף denaturing ביומטריקס החלבון. קבוצות אחרות שילבו טיפול בחום וטיפול בחלבון K כדי להגביר את ההומוגניות9,14,34. בחרנו שלא ליישם את הצעד הזה מכיוון שהוא עלול לפגוע בחלבוני וריון בקצב שמשאיר את הרנ”א הנגיפי חשוף לירידה בחום35. יתר על כן, דילול מדגם עם proteinase K עשוי להסוות דגימות חיוביות המכילות פחות חלקיקים ויראליים ובכך, הפחתת הרגישות. בנוסף, תוצאות הבדיקה הושוו לבדיקת SARS-CoV-2 מבוססת רוק זמינה מסחרית (Logix Smart COVID-19) המשתמשת בהפקת RNA חרוז מגנטי (טבלה 5). נמצא כי הבדיקה הנוכחית התאימה יותר לאיתור דגימות חיוביות חלשות בהשוואה לבדיקה הזמינה מסחרית.
קשה לכמת מספר העתקת וירוס ברוק באמצעות RT-qPCR בלבד, כי qPCR הוא חצי כמותי. קיימת שונות אינהרנטית בין ערכי Ct שמקורם במגבלות טכניות. ניתן לקבוע את מספר עותק הגן מערכי Ct (איור 4) והוא שווה בערך למספר עותק נגיפי. פתרון אפשרי אחד כדי לקבוע את מספר העותק הנגיפי בדגימות רוק הוא ddPCR, המספק כימות קשה של עותקי גנים בתגובה. עם זאת, אנו מאמינים כי זה מספיק כדי לספק תוצאות איכותיות לרופאים ותוכן ויראלי יחסית ניתן להשוות על פני דגימות מעובדות עם השיטות שלנו.
למרות כמה מגבלות המתעוררות בעת שימוש ברוק, בדיקת SARS-CoV-2 על ידי RT-qPCR מבוסס רוק מוכיחה להיות שיטה יעילה לזיהוי RNA ויראלי מהיר ואמין בכל קנה מידה של בדיקות. הדבר נכון במיוחד כאשר יחד עם ניצול של מערכות טיפול בנוזל קוד פתוח. ניתן לשנות גישה זו לבדיקה כדי לזהות רצפי חומצות גרעין אחרים הרלוונטיים לאבחון, כגון סוכני מחלות זיהומיות, סמני מחלות או וירוסים אחרים. זה הופך את הבדיקה ישימה הן למאמצי אבחון קליניים והן למאמצי אבחון מחקריים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים להנהלתו של קלמסון, לצוות הרפואי ולעובדי המעבדה הקלינית במעבדת REDDI שעזרו ליישם ולנהל את בדיקות SARS-CoV-2. אנו מודים לד”ר פיליפ באקהולטס ולד”ר קרולין בניסטר מאוניברסיטת דרום קרוליינה על ייעוץ ראשוני לפרויקטים וקשרים בתעשייה לרכישת ציוד. אנו מודים לסטודנטים, פרופסורים ואנשי צוות רבים על עזרתם באיסוף דגימות. תודה לתלמידי חקירה יצירתית על איסוף נתוני עקומה סטנדרטית. המימון למחקר זה התקבל ממענק המכונים הלאומיים לבריאות P20GM121342 (הוענק ל- DD ו- LGP), מחלקת האתלטיקה של קלמסון, סגן נשיא אוניברסיטת קלמסון למחקר, ומושל דרום קרוליינה & ועדת ביקורת אג”ח משותפת.
100% EtOH | Fisher scientific | 22-032-601 | |
20 uL Filtered Pipette Tips | Opentrons | 20uL tips | |
2mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-313 | Alternate product may be used |
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells | Thermo Scientific | AB3384 | Alternate product may be used |
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates | Fisher Scientific | 50-828-743 | For mastermix preparation |
Clear PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0558 | Alternate product may be used |
DPEC Treated Water | Ambion (Thermo Scientific) | AM9916 | |
Flip Cap 50 mL Conical Tubes | VWR | 75845-210 | For sample collection |
Foil PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0626 | For storage of mastermix plates, Alternate product may be used |
HS_RPP30 Synthetic DNA | Integrated DNA Technologies | 299788131 | P1 positive control |
Luna Buffer Probe One-Step Reaction | New England Biolabs | M3006B | |
Luna WarmStart RT Enzyme Mix | New England Biolabs | M3002B | |
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006830 | |
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006832 | Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores |
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006831 | |
Opentron HEPA Filter Module | Opentrons | N/A | Not required, but useful to reduce contamination |
Opentron Multichannel Attachment, P20 | Opentrons | 999-00005 | For mastermix preparation |
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot | Opentrons | OT-2 | |
Opentron Pipette Attachment, P20 | Opentrons | 999-0000215 | For sample loading |
Oven | Memmert | UF450 PLUS 208V-3PH | |
PCR Tubes (rnase, dnase free) | Fisher Scientific | 14-230-225 | For aliquots of positive and neg controls |
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) | VWR | 10808-952 | |
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) | VWR | 10808-956 | |
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10007062 | Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore |
RNAse P Forward Primer, 100nmol | Integrated DNA Technologies | 10006836 | |
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006837 | |
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 | Twist Biosciences | 102024 / 103907 / 103909 | N1 Positive Control |
Scanners | Code | CR1500 | Only required when scaling up |
Small HEPA Filtered Hood | Erlab | Captair Bio 321 | For mastermix preparation |
Thermocycler CFX384 Touch | Biorad | CFX384 Touch | Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus |
X-acto Knife Set | Staples | N/A | To cut foil for keeping control wells covered |